高通量、低成本 SNP、突變和甲基化檢測方法 ——HRM技術(shù)應(yīng)用

高通量、低成本 SNP、突變或甲基化檢測方法
——HRM技術(shù)應(yīng)用

HRM介紹

    HRM技術(shù)是 high-resolution melting analysis即高分辨熔解曲線分析技術(shù)，是近年國外興起的一種全新的突變掃描和基因分型的遺傳分析方法�；�于高效穩(wěn)健的 PCR技術(shù)，HRM不受突變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，在 PCR結(jié)束后直接運行高分辨熔解，即可完成對樣品突變、單核苷酸多態(tài)性 -SNP、甲基化、 HLA配型等的分析。

    因操作簡便快速，使用成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，實現(xiàn)了真正的閉管操作， HRM技術(shù)受到普遍關(guān)注。

HRM原理

    HRM的主要原理是根據(jù) DNA序列的長度， GC含量以及堿基互補性差異，應(yīng)用高分辨率的熔解曲線對樣品進行分析，極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度達(dá)到對單個堿基差異的區(qū)分。隨著高精度 PCR儀（ LightCycler® 480和 Rotor-Gene 6000）和飽和染料（ LC Green、 Eva Green等）的出現(xiàn)，HRM技術(shù)的普及使用成為可能。 
 
HRM應(yīng)用

SNP（單核苷酸多態(tài)性）的篩查。

 基因突變掃描，包括缺失、重復(fù)、點突變。

 新突變的篩查。

 甲基化的篩查。

    遺傳育種中特定突變的篩查、未知突變的發(fā)現(xiàn)。

 HLA基因組配型、等位基因頻率分析、物種鑒定、品種鑒定、甲基化研究。

 法醫(yī)學(xué)鑒定、親子鑒定。

 動植物品質(zhì)相關(guān)多態(tài)性位點的研究等。植物抗逆性，突變與性狀關(guān)聯(lián)性研究。

HRM特點

 高通量：1次可同時檢測 10-384樣本，適合大樣本、多 SNP、多突變位點及多位點甲基化的掃描。

 高敏度：腫瘤研究中低突變率樣品基因突變檢測，最低檢測到 0.1%的突變樣品基因突變，即檢測到 1000個正常細(xì)胞中 1個突變細(xì)胞，適用于手術(shù)和其它微量組織中突變檢測。檢測靈敏性遠(yuǎn)高于“ PCR+測序”的 25%，即 100個正常細(xì)胞中至少有 25個突變細(xì)胞，測序僅適用手術(shù)組織。

 特異性好：PCR產(chǎn)物無需后續(xù)處理，特異性高達(dá) 100%。直接未知雜合突變鑒定準(zhǔn)確性 100%，特異性 100%。直接未知純合突變鑒定準(zhǔn)確性 96%，利用非標(biāo)記探針快速基因分型法直接未知純合子鑒定準(zhǔn)確性 100%。

 重復(fù)性好：重復(fù)性 100%

 使用范圍廣：不受堿基位點局限，除可檢出已知突變外，也能檢測出未知突變。

 重復(fù)性好：樣品 PCR和 HRM分析直接在同一管內(nèi)進行，實現(xiàn)閉管操作，避免交叉污染。

 操作簡便：只需設(shè)計特異引物，無需序列特異性探針，無需測序，也不受突變堿基位點與類型的局限。

 成本低：簡化操作時間和步驟，大大降低成本，檢測費用遠(yuǎn)少于測序、 Taqman探針技術(shù)。

 標(biāo)本范圍廣：可用于新鮮或酒精固定、石蠟包埋的手術(shù)標(biāo)本，也可用于微量的穿刺或活檢標(biāo)本、血液標(biāo)本、糞便標(biāo)本等非手術(shù)標(biāo)本的檢測。傳統(tǒng) PCR+測序”方法難以檢測大部分不能手術(shù)的患者。

 其它：只檢測 PCR樣品中熒光強度的變化，不消耗任何 PCR樣品，無污染， PCR產(chǎn)物可以進行下游分析，非常適合于測序前的 SNP、甲基化等預(yù)掃描篩查。

HRM應(yīng)用舉例

SNP檢測

    單核苷酸多態(tài)性（ Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs），指單個核苷酸堿基的改變，包括置換、顛換、缺失和插入，導(dǎo)致的核酸序列的多態(tài)性。在不同個體的同一條染色體或同一位點的核苷酸序列中，絕大多數(shù)核苷酸序列一致而只有一個堿基不同的現(xiàn)象，這就是 SNP。SNP在人類基因組中數(shù)量較多，發(fā)生頻率較高，因此被認(rèn)為是繼微衛(wèi)星之后的新一代遺傳學(xué)標(biāo)記。

    HRM檢測 SNP技術(shù)是依據(jù)在一定的溫度范圍內(nèi)將 PCR擴增的產(chǎn)物進行變性，期間實時檢測體系內(nèi)熒光信號。熒光值隨著溫度變化，可繪制溶解曲線。每一段 DNA都有其獨特的序列，因而也就有了獨特的熔解曲線形狀，如同 DNA指紋圖譜一樣，具有很高的特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。根據(jù)曲線準(zhǔn)確區(qū)分野生型純合子、雜合子和突變性純合子（下圖）。

    檢測 SNP的方法有很多種。成本較低、通量較大的方法大都局限于已知、特定位點，如 Taqman探針法。既要對已知位點分析又要查找未知位點，一般采用 PCR+測序的方法，成本高、操作繁復(fù)較低。

    HRM技術(shù)是一種低成本、高通量、快速，且不受位點局限的檢測方法，是 SNP篩查的最佳選擇。  

甲基化檢測

    DNA甲基化是 D NA堿基序列 C pG島上常發(fā)生的一種共價修飾，使基因表達(dá)受抑制，可以遺傳。在腫瘤等病理組織中，特異基因的特征性甲基化狀態(tài)可以作為早期診斷的重要標(biāo)志物。甲基化檢測包括特異性 P CR、Northern印跡法、芯片等，測序是金標(biāo)準(zhǔn)，但這些方法低通量、成本高、花費大量時間且難以標(biāo)準(zhǔn)化。
    高分辨率熔解（H igh ResolutionMelt,HRM）是一種最新的在表觀遺傳學(xué)中檢測 C pG位點的一種新技術(shù)，可區(qū)別單個堿基的甲基化差異（下圖）。 

    HRM檢測甲基化的方法具有高通量、操作簡單、靈敏高、重復(fù)性高、成本低、不受檢測位點的局限高度等優(yōu)勢，將對于遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)等方面的研究和臨床應(yīng)用提供更大的幫助。

突變篩查

    HRM的特點是高特異性和高靈敏度，檢測靈敏度可以達(dá)到 1%-0.1%。在大量樣本、多個突變位點的篩查上，比傳統(tǒng)的非均一性方法（如 dHPLC）更方便、性價比更高，因為后者需要將擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到另一臺儀器上進行突變分析。

    HRM可對任何擴增子上的未知突變進行篩查，不需要識別不同等位形式的引物或探針，不受突變堿基位點和種類的局限，既可以對未知突變進行篩查、掃描，又可以對已知突變進行分析。所以，相比定量探針法的突變分析和其它類型的快速突變分析法，應(yīng)用面大大拓展，成本也大大降低，成為近年來國外新興的遺傳學(xué)、方法學(xué)研究和應(yīng)用熱點。 

圖：HRM分析 219bp的人類 MBL-2基因片段（384個樣本），結(jié)果顯示了四種主要的基因類型（藍(lán)色、紅色、綠色和橄欖綠色）和兩個少數(shù)樣本的基因型（橙色和紅紫色）。

其它應(yīng)用
植物和動物品質(zhì)和育種中基因型鑒定：HRM方法快速而有效的解決如何確定親本的基因型是否相同、有否新型性狀的遺傳突變等問題。
HLA基因組配型：器官移植的 HLA配型、同胞之間 HLA基因型確定，應(yīng)用舉例：快速確定 HLA高度多態(tài)性位點的類型，及非親源關(guān)系個體間異源造血干細(xì)胞移植前的 HLA基因型確認(rèn)。
等位基因頻率分析：SNP頻率分析等。
物種鑒定、品種鑒定：微生物品種、物種快速鑒定；動植物品種鑒定。應(yīng)用舉例：臨床細(xì)菌的鑒定。對臨床細(xì)菌的培養(yǎng)物進行 16SrRNA的實時擴增，并進行 HRM分析，每個菌種的熔解曲線模式就如果該物種的分子指紋，從而可以根據(jù) HRM的不同對細(xì)菌進行鑒定。
法醫(yī)學(xué)鑒定、親子鑒定：檢測單核苷酸多態(tài)性 SNP鑒定，插入 /缺失多態(tài)性 DIP鑒定等。應(yīng)用舉例：將 HRM用于法醫(yī)學(xué) SNP、DIP鑒定，協(xié)助犯罪鑒定，親子鑒定。相對于傳統(tǒng)鑒定方法，HRM是一種簡單、便宜、高通量的二等位基因分子標(biāo)記鑒定的方法。

樣品處理：

 組織標(biāo)本：取新鮮組織塊 50mg，一種用液氮或干冰保存、運輸，另外可放入裝有含 RNAlater凍存管（本公司提供），4℃低溫保存并常規(guī)冰袋運輸。

 穿刺或者活檢標(biāo)本：處理方式同上。

 酒精固定標(biāo)本：對于不能送檢新鮮標(biāo)本的送檢者，請將標(biāo)本從手術(shù)臺上取下后，立即切取腫瘤標(biāo)本（≥5mm3），放于容器內(nèi)（如帶蓋的塑料瓶），采用 75％的乙醇立刻固定，保證酒精的體積是標(biāo)本的 5倍左右。

 石蠟包埋組織切片：要求提供 10張組織切片（面積 >10 mm×10 mm，厚度約 5－10μm），載玻片片盒保存、常溫運輸。如果組織太小，請酌情增加送檢樣品數(shù)量。

 血液樣本：取 5ml抗凝血，獲得血漿，常規(guī)冰袋 4℃低溫運輸。

 胸腹水：腫瘤胸腹水離心后加 75%的酒精 1 ml。

 糞便：收集 10g糞便，用柱式離心的方法收集基因組 DNA。

參考文獻(xiàn)

  Oliver Geulen, Christian Weilke, Michael Hoffmann.The LightCycler 480 real-time PCR system: a versatile platform for genetic variation research. Nature Methods 5, (29 February 2008) doi:10.1038/nmeth.f.207. 
  The LightScanner System: Ultra Fast Mutation Discovery and Gene Scanning Nature Methods Application Notes (2 May 2006) doi:10.1038/an1611.
 Erali M, Voelkerding KV, Wittwer CT. 2008. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Exp Mol Pathol 85:50–58. 
  Wojdacz TK, Dobrovic A, Hansen LL. Methylation-sensitive high-resolution melting. Nature Protoc. 2008;3(12):1903-8. 
  Fukui T, Ohe Y, Tsuta K, Furuta K, Sakamoto H, Takano T, Nokihara H, Yamamoto N, Sekine I, Kunitoh H, Asamura H, Tsuchida T, Kaneko M, Kusumoto M, Yamamoto S, Yoshida T, Tamura T. Prospective study of the accuracy of EGFR mutational analysis by high-resolution melting analysis in small samples obtained from patients with non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2008 Aug 1;14(15):4751-7. 
  Smith GD, Chadwick BE, Willmore-Payne C, Bentz JS. Detection of epidermal growth factor receptor gene mutations in cytology specimens from patients with non-small cell lung cancer utilising high-resolution melting amplicon analysis. J Clin Pathol. 2008 Apr;61(4):487-93. 
  Takano T, Ohe Y, Tsuta K, Fukui T, Sakamoto H, Yoshida T, Tateishi U, Nokihara H, Yamamoto N, Sekine I, Kunitoh H, Matsuno Y, Furuta K, Tamura T. Epidermal growth factor receptor mutation detection using high-resolution melting analysis predicts outcomes in patients with advanced non small cell lung cancer treated with gefitinib. Clin Cancer Res. 2007;13(18 Pt 1):5385-90.
 Simi L, Pratesi N, Vignoli M, Sestini R, Cianchi F, Valanzano R, Nobili S, Mini E, Pazzagli M, Orlando C. High-resolution melting analysis for rapid detection of KRAS, BRAF, and PIK3CA gene mutations in colorectal cancer. Am J Clin Pathol. 2008;130(2):247-53.
 Chagné D, Gasic K, Crowhurst RN, Han Y, Bassett HC, Bowatte DR, Lawrence TJ, Rikkerink EH, Gardiner SE, Korban SS. Development of a set of SNP markers present in expressed genes of the apple. Genomics. 2008;92(5):353-8.