多個序列突變的篩查-HRMA

多個序列突變的篩查-高分辨率熔解曲線分析（HRMA）

摘要：雙鏈DNA分子轉化為兩個單鏈分子，DNA分子變性或熔解用于研究DNA結構和組成已經(jīng)有多年。最近，新技術的進步提高了這種技術的潛力，尤其是用于DNA序列突變的檢測。通過飽和DNA染料的發(fā)展和設備的改善，熔解的靈敏度和特異性有了很大的提高（改良的溫度精確地結合每個時間單位溫度的精確測量）。熔解分析已使用這些新設備用于高分辨熔解曲線分析（HRM或HRMA）�；�于它的易用性、靈活性、低成本、非破壞性、高靈敏度和特異性的特點，高分辨熔解曲線分析已成為篩選病人致病突變的首選工具。這里我們將簡短地討論高分辨熔解曲線分析目前的發(fā)展，特別回顧它在其它方面的應用，包括前序列篩查，單核苷酸多態(tài)性分型，甲基化分析，定量（拷貝數(shù)變異和鑲嵌性），替代凝膠電泳和克隆�？傊�，這些不同的應用使高分辨率熔解曲線分析成為了一種多用途的技術和標準，可用于任何核酸研究的實驗室中

關鍵詞：突變篩查；甲基化；熔解曲線分析；HRM；HRMA

硬件

    有幾個供應商生產高分辨熔解曲線分析系統(tǒng)（HRM或HRMA）。整體而言，這些系統(tǒng)能達到預期的結果，但是差異很大[Herrmann et al., 2006, 2007]。目前可用的靈敏度最高的系統(tǒng)是HR-1(鹽湖城市，由他大學，愛德華科技有限公司)，熒光信號產生于55—95℃，溫度以0.1℃/s升降，200個數(shù)據(jù)點/℃。一些實驗，例如，多個SNP測定[Seipp et al., 2008]，關鍵取決于這個分辨率。HR-1使用玻璃毛細管每次分析一個樣品；其它玻璃毛細管系統(tǒng)可分析32個樣品。微孔板系統(tǒng)更受歡迎、使用方便，可同時分析96或384個樣品。另一個區(qū)別是系統(tǒng)是否僅用于高分辨率熔解曲線分析或是否是PCR結合高分辨溶解曲線分析的設備。Rouleau等很好地證明了定量PCR結合HRMA設備在同一個實驗中可以用于定量（缺失/重復）和定性（核苷酸）的改變。
    在大多數(shù)系統(tǒng)中小的板孔之間的溫度差異影響靈敏度。Seippet al. [2007]通過增加控制溫度的低溫和高溫溫度校準探針避免這個問題。分析軟件可以利用探針的熔解位置彌補板孔之間的溫度差異，減小Tm標準偏差38%，顯著地提高了靈敏度。值得注意的是，高分辨熔解曲線分析軟件的使用決定最終靈敏度的重要因素[Herrmann et al.,2007]，但并不是所有的軟件包有利于溫度校準探針的使用。
    LC-Green是第一種可用的飽和染料[Wittwer et al.,2003];目前，已有多種飽含染料。包LCGreens1(IdahoTechnology Inc.), Syto9s (Invitrogen, Carlsbad, CA), EvaGreens (Biotum) 和LightCyclers 480 ResoLight Dye (Roche, Indianapolis,IN)。價格差異很大；所有的飽和染料都有一些差異，它們對PCR緩沖液和反應條件要求略有不同。
高分辨熔解曲線分析的完成非常簡單。最簡單的設置，不需要對現(xiàn)有條件修改，添加染料后進行PCR熔解。這個簡單方法允許我們，例如很快的區(qū)分apoE等位基因的所有可能情況（Fig.1A）。ApoE使用其它分型技術存在許多問題，主要是要求每個等位基因區(qū)分開。最后，高分辨熔解曲線分析是一個閉管實驗，染料在PCR反應前加入更好。如果實驗要求改變PCR條件，通常可以增加鎂離子濃度2-3 μL，退火溫度增加1-5℃。當鎂離子濃度升到設備的最大溫度以上時，加像二甲基亞砜（10%）或犢牛血清（0.5M）可以降低Tm值。對于復雜的實驗，使用梯度PCR儀可以快速的確定最佳的退火溫度。
高分辨率熔解曲線分析在不同實驗室不要求有大的改變，同時也不要特別的技術；它是在有特殊染料存在的條件下PCR條件過程進行小的修改。最昂貴的是設備的購買。在10,000-50,000歐元之間，根據(jù)系統(tǒng)，甚至其它一些技術相比它并不遜色。因為高分辨率熔解曲線分析不像許多其它技術（例如，SSCA，DHPLC，DGGE,或毛細管電泳），不需要PCR后分離，更重要的是節(jié)省成本。此外，高分辨熔解曲線分析是一個非破壞性的技術，同時可以進行后續(xù)的分析，比如，熔解分析后進行凝膠電泳或測序。

圖1.使用高分辨熔解曲線分析檢測序列突變。A：檢測所有六個可能的ApoE等位基因組合；PCR后高分辨熔解曲線分析前添加LC-Green+染料（PCR包含10%DMSO）。ApoE 3/3等位基因作為標準（水平的灰線）。B-D：使用氨基封閉的非標記探針檢測MBL2基因第一個外顯子的3個獨立突變(Roos et al., in preparation)。B：衍生圖全圖；C:放大的低熔解探針和D：（PCR片段）Tm峰。使用熔解圖10種等位基因可以清楚地區(qū)分。

應用

突變檢測

    高分辨熔解曲線分析已用于DNA序列突變的檢測，是第一個用于基因分型中的技術[Wittwer等,2003]。簡便、廉價、容易使用、高靈敏性和高特異性是它的突出特點，使它成為一種用于基因分型和診斷應用實驗室中有吸引力的新工具。在薩普，表S1給出了我們所能找到的基于人類基因的實驗。高分辨熔解曲線分析系統(tǒng)結合功能強大的軟件工具可以便利地自動分析，然而人工檢測依然可用。目前，使用高分辨熔解曲線分析檢測突變已經(jīng)通過審查[Erali et al., 2008];因此，我們僅用于一般解釋。此外，高分辨熔解曲線分析用于人類突變的檢測已經(jīng)有多篇文章發(fā)表。充分說明了其目前的發(fā)展水平(see also Supp. Table S1)。
    Tindall等[2009]對比了兩種設備和熒光染料，特別是高GC含量片段DNA突變的檢測。 他們說明了高分辨熔解曲線分析的限制，謹慎使用它作為臨床診斷的唯一方法。Nguyen-Dumon等[2009]表明包含使用已知SNP結合稀有突變熔解探針顯著減少測序的能力。Van Der Stoep等[2009]類似的方法設計了覆蓋BRCA1基因的序列突變掃描，包括已知頻率SNP的熔解探針。EuroGenTest通過多個實驗室進行評估和驗證HRMA作為新基因篩查的準則。在對28個失明患者的研究結果為100%的靈敏度、98%的特異性，假陽性率低。Rouleau等[2009]在同一個實驗中使用一些設備完成定量PCR和HRMA去篩查核苷酸數(shù)量（缺失/重復）和質量的改變。最后，Dobrowolski 等[2009]描述了在兩小時之內使用HRMA掃描16.6kb人類線粒體基因組（mtDNA）序列突變。線粒體DNA突變的識別比較復雜，因為許多是異質的，同時突變等位基因以高變化率存在。事實上，作者成功地確認在1-100%的突變存在，很好地顯示了HRMA檢測定量變化的靈敏度（見量化）
    盡管已有報道HRMA片段達600bp或更高，但我們的實驗顯示該技術對小片段更靈敏。對于片段篩查，使用150-250bp片段，通常每個外顯子一個片段。當實驗進行的是特異突變，我們的目標片段大小是80-100bp。我們發(fā)現(xiàn)高靈敏度的關鍵是熔解圖不會超過一到兩個熔解區(qū)域。當片段包含了多個熔解區(qū)域，并不是所有的突變能檢測出來。目前新的實驗設計簡化了強大的可用性設計項目，大多數(shù)情況下是和儀器一起交付。
    在早期HRMA實驗中可以看到兩個有時甚至三個PCR產物熔解，可以提高結果。同樣，特別是當DNA片段分濃度差異較大時，添加1 μL高鹽緩沖液（1.0M KCL,0.5M Tris-HCL [PH=8.0]）可以改善實驗結果（圖 2）。添加鹽可以提高分辨率同時促進集群，但這種方法的成功率是不可預測的，它取決于樣品、片段和突變分析。

圖2.高鹽的影響.A:HRMA一系列樣品的分析。B：同樣的樣品在A分析后添加1 μL 1.0M kcl/0.5M Tris-HCl(PH=8.0)再熔解。留意分離的改善和三組圖像變尖。

    當一些簡單的原則都考慮到時（比如，避免長片段和多重熔解域），設計一個基因的HRMA篩查非常簡單。我們曾成功地設計實驗篩查MDM基因第79個外顯子90個片段(Al-Momani et al)。Nguyen-Dumont 等 [2009] 和Van Der Stoep 等[2009]表明，非標記探針識別已知非致病突變時，不僅省時而且能夠節(jié)約成本。防止這些片段不必要的測序，同一個片段避免忽略其它突變。
    應該指出HRMA曲線的形狀通常不足以區(qū)分一個特異突變[Tindall 等, 2009];完成這個實驗必須添加探針或片段測序。非標記探針區(qū)分特異探針或復等位基因的能力式驚人的。圖1B-D為例子(Roos 等，準備)。使用包含野生型序列的熔解探針可以區(qū)分MBL2基因中三種相近空間突變的10種可能等位基因。
    最便宜的熔解探針3ˊ磷酸鹽封閉可以防止PCR過程中的延伸。遺憾的是，這種探針不穩(wěn)定，同時會出現(xiàn)不理想的額外熔解峰。其它探針較穩(wěn)定但價格昂貴。Zhou等[2008] 使用snapback 引物完美的解決了這個問題，它是5ˊ端引物包含了循環(huán)區(qū)域和序列互補其延伸產物，覆蓋突變篩查。 HRMA的一個缺點是對純合子突變的檢測。盡管隨著目前的發(fā)展分辨率已得到很大提高 [Gundry 等.,2008],  對一些突變的差異（如A-T到T-A改變）由于變化非常小所以很容易錯過。尤其是分析不同來源的樣品，樣品到樣品的變化、實驗噪音增加和微小的變化可能不能被檢測到。因此，序列突變篩查應用時（臨床診斷），我們堅持使用樣品混合產生異源雙鏈。首先，樣品熔解得到一個標準的熔解曲線。下一步，使用圖表顯示（圖3為DMD設計，X軸與疾病相關），混合樣品同時產生第二個熔解曲線。樣品混合圖每個樣品產生了兩個雜交雙鏈（樣品很容易地自動混合）。純合子將產生兩個雜交雙鏈，極大地提高了純合子的檢測。雜交雙鏈將通過預混的熔解曲線檢測到，盡管它們通常通過混合樣品顯而易見。（混合比例為1︰3）。當混合相同突變樣品時，僅顯示失敗的樣品，可以通過增加更多的控制或僅混合不相關的樣品可以簡單地預防 。必須指出 體系的存在可以從真正的純合子等位基因區(qū)分半合子。

圖3.生成異源雙鏈。為了確保純合子突變的檢測，可以使用顯示的方案。板孔1-12包含每個樣品（患者A-F和wt=wild-type控制）不同片段（外顯子）的PCR產物。第八排為空。從第一個從第七排（wt，5-10 μL PCR產物）樣品的一半HRMA混合開始，然后轉向第八排。隨后，第六排一半量轉向第七排，第五排一半轉向第六排等等等。最后，第八排轉向第一排，然后片段再次熔解。

    應當指出，HRMA檢測雜合子的靈敏度高于DNA測序。因此，當HRMA顯示突變存在，而測序不能確認時�？赡苁沁@個突變存在也樣品相對小的片段（體細胞嵌合體）。其它技術：如，克隆+測序或單分子稀釋+PCR和HRMA，可以確認這些突變。

前序列篩查

    使用HRMA進行前序列篩查，特別是對于大基因可以節(jié)省很大的成本；Provaznikova 等[2008]報道對于MYH9基因可以避免85%的測序。在例中的DMD基因，第79個外顯子需要分析(Al-Momani 等)，假定每個外顯子測序需要10歐元，篩查一個患者總共需要800歐元。每個外顯子PCR花費1歐元，HRMA染料花費0.1歐元，每個患者估計花費90歐元。假定序列分析需要5個外顯子熔解需要分析（包括一個致病突變，三個非致病突變和一個假陽性）需要增加50歐元，總花費為140歐元。每名患者將節(jié)省650歐元，當使用熔解探針去確定常見非致病突變存在時，將會減少更多的花費。事實上，基于這些圖，五個外顯子基因的HRMA預篩查已經(jīng)很劃算。此外，檢測體細胞的變化或異質性[Dobrowolski 等.2009],HRMA比測序似乎更靈敏。
 
SNP分型

    HRMA用于SNP分型有很大的吸引力。實驗設計廉價、簡單、速度快。當在一個特定區(qū)域設計一到兩個PCR覆蓋一個SNP，至少一個通常兩個將得到很好的結果。提高靈敏度，片段必須夠�。�80-100bp），當可以選擇時（比如：在單倍體中）應選擇G-A突變（預計得到最大的熔解變化）[Reed 和Wittwer, 2004]。推薦添加非標記探針[Nguyen-Dumont 等, 2009; Zhou 等,2008]，得到了雙重檢測同時提高了純合子突變檢測率。當設定的引物到達時，不用做一到兩次的 PCR去摸索擴增條件。檢測成本僅僅PCR費用，實驗設計花費可以忽略。除非有大量的樣品需要分型，染料成本相對于實驗成本包括具體的標記探針（例如，TaqMan）而言比較低。HRMA樣品吞吐量可以通過使用自動進樣板增加，在一些系統(tǒng)中可用一些延伸或安裝一個附加的進樣器。
    根據(jù)上面描述的陽性結果是否重復可變數(shù)目，特別是CA重復，可以被HRMA分型（圖4）。雖然樣品所有的熔解曲線可以清楚地被區(qū)分，我們發(fā)現(xiàn)所有可能結合的等位基因很多，所以雜合子CA重復分型不能準確確定�？梢酝ㄟ^小的家族去檢測家族成員間的差異同時研究雜合子樣品的雜合性（LOH）缺失。正如Intemann等[2009]的實驗結果，可以推測熔解探針的添加跨越最小的或最大的等位基因可以更大的增加分辨率。
HRMA的一個缺點是不能輕易應用使用多重模式，同時進行幾個不同片段同時分型突變。按理來說，可以利用顏色差異，溫度差異完成多重模式。Seipp等[2008]利用最簡單的方法，Tm差異成功地設計了一個四倍體基因分型實驗。然而，這些設計時間多少和成功決定于高質量的DNA樣品和HRMA系統(tǒng)的靈敏度使用。

圖4.  使用HRMA分析CA重復。 六個不同DNA樣品重復分析，所有的都是雜合子。上圖：歸一化溫度變化熔解3=14/17,4=14/18,5=15/21,6=14/21。

甲基化

    目前，基因組研究經(jīng)常涉及表觀遺傳學標記，尤其是CPG二核苷酸在基因表達、印記和腫瘤的甲基化(Ehrich等2006)。這些程序關鍵的步驟是基因組DNA的處理，不斷改變的非甲基化C核苷酸（不是甲基化Cs）到我們。HRMA可以應用在這些研究中的兩個階段。首先，成功治療的前后可以通過控制的基因組片段的PCR檢測，沒有甲基化的CPGs和100%甲基化樣品樣品的熔解曲線。越接熔解圖近類似于片段100%的轉變，治療后越好[Worm等.2001]。其次，HRMA可以用于確定C-U轉變的百分率，直接用于熔解探針的結合[Maat等.2007]或克隆后。

量化— 確定鑲嵌性和拷貝變異數(shù)量
                                                                 
    根據(jù)熔解曲線變化,HRMA可以用于量化分析；較大的變化、較小的差異可以被檢測到。確定突變分子數(shù)量常用的技術為雙氧法測序（分辨率下限為20-30%）和焦磷酸化測序法（下限為1-10%）。雖然功能強大，焦磷酸測序法是一種勞動密集、昂貴同時需要專門設備的方法。我們成功的應用HRMA確定不同等位基因的數(shù)量[Aten等, 2009; Bruder等, 2008]，同時顯示檢測12.5%的步驟（1/8）通常是可以的[Aten等2009]。結腸癌中體細胞檢測的應用見圖5。使用稀釋系列作為一個標準，可以快速確定三個疑似攜帶致病突變患者的體細胞嵌合體水平達5-10%。這些數(shù)據(jù)和通過焦磷酸測序獲得的結果完全吻合[Hes等,2008]。然而檢測費用低廉同時易于操作。應當指出當使用熔解探針時分辨率會提高到5%以下。等位基因表達差異確定的其它應用，基于突變在mRNA中的存在和mtDNA雜合子的檢測[Dobrowolski等, 2009]。

    目前，我們使用相同的方法研究一對雙胞胎細胞攜帶體細胞缺失的片段。[Bruder等, 2008]。當篩查患者基因組改變相關疾病時，采用該方法也可以用于確認CNVs（缺失和重復）。根據(jù)不同的設置，像FISH、MAPH   [Armour等, 2000],  MLPA [Schouten等, 2002], MAQ [Suls等, 2006], 和 qPCR 技術可以用于確認陣列結果。然而這幾項技術要么成本昂貴要么需要進一步的發(fā)展。任何可疑區(qū)域的SNP都可以使用HRMA確認。這些純合子樣品對于的等位基因（AA和BB）和潛在的攜帶變化的樣品1﹕1混合。假定檢測樣品攜帶了A等位基因，要么是AO,要么是AA。當與純合子BB樣品1:1混合，缺失確定時，熔解圖樣品AA:BB以1：2的比例混合（AOBB）。當樣品AA:BB以1：1比例混合時，缺失不存在  （AABB）。當1：1純合子樣品BB樣品 與3：2 AA: BB樣品混合（AABB）。                                                                   

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