通過溫度內(nèi)標提高高分辨熔解曲線中純合子檢測的靈敏度

摘要

應(yīng)用高分辨率熔解曲線技術(shù)進行基因分型不僅簡單而且有效�；�于熔解曲線的分析方法中，探針法是進行基因分型的金標準，能夠全面的檢測匹配的目的等位基因。小片段擴增法是一種不需要設(shè)計探針進行基因分型的方法。由于異源雙鏈的存在，雜合子很容易檢測，而這很大程度上改變?nèi)劢廪D(zhuǎn)化的峰形。純合子基因分型中G/C或A/T的改變是最難檢測的，因為它們的等位基因有相似的Tm值。那些稱為中性純合子的堿基對使用小片段法是很難區(qū)分。此外，純合子難區(qū)分也受樣品與樣品間溫度的變化，緩沖液和體積的限制。無論多么精確的儀器，相關(guān)的變化可能是顯著的，所以需要一種方法來減少這種變化并且改善小片段基因分型。而使用特異性內(nèi)標就可以克服這些限制。

背景

人工合成的寡核苷酸內(nèi)標和互補序列包含相同的分子濃度。在內(nèi)標存在的情況下，使用普通96孔板PCR儀，并添加LC Green® Plus染料進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)完成后將PCR產(chǎn)物放入Lightsanner儀器，在55℃到97℃進行熔解曲線分析。內(nèi)標的溶解識別通過每個樣品的熒光數(shù)據(jù)進行校準�；�因型通過測序進行驗證。通過測量每個樣品組相應(yīng)的基因型的Tm值峰間的距離來估算校正前后的純合基因型檢測的錯誤率。當樣品的Tm值與錯誤組的Tm值接近時，錯誤將被檢測到。

結(jié)果

通過使用不同微孔板和PCR模板驗證，使用溫度內(nèi)標校準后，純和基因型在中性單核苷酸多態(tài)性堿基對檢測的靈敏度提高了90%到99%以上。使用溫度內(nèi)標后Tm值標準較低大約0.056到0.027℃。

結(jié)論

內(nèi)標提高小片段內(nèi)的純和基因型G/C和T/A堿基的改變。該研究被國家衛(wèi)生部以下部分津貼支持：R44DK069106 、R44HD053215 to SFD 、 R42GM072419 和R42GM073396 to CTW。

背景

變性或熔解時，由于核酸固有特性的不同使得基因型信號會發(fā)生變化�；�于探針的基因分型在相關(guān)的大量的等位基因特異性在溫度變化幾度上有較大的優(yōu)勢。高分辨率熔解曲線提供了整個雙鏈的熔解圖并且可以去掉探針。此外，每個實驗當整個擴增子被監(jiān)測時，獲得的堿基審問數(shù)量增加達20倍。由于非常相似的熔解圖和熔解溫度，使純和基因型在沒有探針的情況下檢測難度增加。小片段提供了一個簡單的基因分型方案。
值得注意的是，與大片段擴增子相比小片段擴增能夠更好的進行純合子檢測，因為特異基因型Tm值變化將更大。但是，某些因素可以影響大量純合子的分離。從堿基類型Tm值變化到設(shè)備變化和樣品和樣品的不同都能影響基因分型。溫度內(nèi)標可以減小這些變化，固定熔解轉(zhuǎn)變和提高基因分型的靈敏度。當小片段引物僅僅對側(cè)翼的SNP匹配時，將會得到最好的結(jié)果。

方法

PCR反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)體系中加入1X LightScanner高靈敏度Mastermix，該Mastermix包含熱啟動酶，鎂離子緩沖液，其它成分和核酸校準，該PCR的熔解區(qū)間大約在62C和92C。體系中包括0.10μM或0.15 μM的引物，人基因組DNA10-15 ng。PCR循環(huán)條件如下：95C預(yù)變性2min，94C/30s，64-67C/30s(根據(jù)實驗而定)包含退火和延伸，45個循環(huán)。最后的退火條件為28C/30s。所有DNA樣品的基因型通過探針法檢測。
熔解在96孔板的LightScanner設(shè)備上進行，數(shù)據(jù)采集從55-97C。熔解后數(shù)據(jù)校準首先使用接近熒光數(shù)據(jù)的平滑線條，接下來，將使用該數(shù)據(jù)的線條插值峰計算Tm值。這一調(diào)整過程可以校準每個擴增子的熔解峰，以達到最小的變化。數(shù)據(jù)重新使用LightScanner軟件進行分析。擴增子Tm值附近的溫度區(qū)域用于分析（有或沒有以前內(nèi)標校準）同時以衍生峰顯示。

結(jié)果

使用溫度內(nèi)標前的完整熔解圖見圖1，圖中標出了從低溫內(nèi)標到高溫內(nèi)標的熔解圖，中間為擴增子的熔解圖。

圖1. 衍生的熔解曲線顯示了內(nèi)標和擴增子的熔解峰。內(nèi)標的熔解峰在左右兩側(cè)。94個熔解圖產(chǎn)生于獨立的PCR反應(yīng)，熔解峰大約出現(xiàn)在76C。內(nèi)標分子沒有校準，純合子的峰沒有完全分開。中間最窄的和最高的峰是A/A(藍色)和T/T(紅色)，它是CPS1 A/T多態(tài)性的純和基因型。先前基于探針的基因分型顏色已經(jīng)增加,不是基于這個小片段熔解數(shù)據(jù)。中間的另一個峰是A/T雜合子峰。插圖顯示的是放大的熔解峰。
                       

圖2. 使用溫度內(nèi)標能夠改善衍生的熔解曲線。熒光圖顯示了CPS1、OTC,MSH2和PAH突變94個獨立的PCR反應(yīng)。雙峰CPS1雜合子在校準前很容易被區(qū)分出來（圖2a）。相反，OTC雜合子（圖2c）僅顯示了一條主要的峰，更多的峰在校準前很難區(qū)分。使用溫度內(nèi)標后的基因型數(shù)據(jù)分更加容易，重復(fù)反應(yīng)中沒有發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)不同的基因型。

表1  比較每個目的基因使用溫度內(nèi)標前后四個重復(fù)的Tm。在所有情況下，校準后差異降低�？梢钥闯�，校準后標準差和非感興趣區(qū)域差異都降低。

                                                    表1.校準對Tm值影響的統(tǒng)計

表1. 每個重復(fù)盤包含了相同設(shè)置的47個基因組DNA樣品（94個獨立的PCR反應(yīng)）。基于所有純合子鄰近參數(shù)預(yù)測的Tm列于表中。雜合子Tm值不包含在內(nèi)，因為它們通常在我們的系統(tǒng)中不用校準就可以分型。在某種程度上，由于LCGreen染料的存在，穩(wěn)定的DNA雜交得到的實際Tm值要比理論值高5-7℃�；�因分型沒有調(diào)準是指未校準和標定Tm值有顯著差異。（p＜0.001）。
對于CPS1和OTC PCR產(chǎn)物，分析預(yù)測近鄰值未發(fā)現(xiàn)純合子T/T和A/ATm的不同。然而，兩個靶基因，即使沒有校準， 純合子群體Tm值也是不同的。盡管，從看到的Tm值范圍上看，校準前純合子T/T和A/A重疊。校準后，純合子T/T和A/A沒有重疊，說明純合子已經(jīng)區(qū)分開了（表1）。對于MSH2和PAH小片段產(chǎn)物，鄰近值分析預(yù)測純和擴增子之間有小的Tm值差異。校準前分析純合子間的變化顯示不能清楚的區(qū)分基因型。校準后，純合子基因型的錯誤估測見表2。

                                               表2.校準提高純合子檢測靈敏度

表2. 實驗數(shù)據(jù)顯示了校準對靈敏度的影響。可以看出校準后檢測靈敏度提高10%。實驗中，正確的估計基于近似的Tm值， 而不是Lightsanner軟件預(yù)測。每個目標小片段的錯估預(yù)測將顯示出來。
*OTC T/A突變的rs數(shù)未標出。

軟件自動校準

隨后的工作是用Lightsanner 軟件自動對相似的圖像的樣品進行分組。這種圖形的基因分型不需要對Tm值了解。對在這種基于Tm值的基因分型已經(jīng)經(jīng)過證實，這種基于圖形的分型受益于溫度內(nèi)標的使用。圖3可以看出通過校準CPS1的小片段產(chǎn)物得到改善。

圖3. 溫度內(nèi)標能夠改善Lightsanner軟件自動校準。下面的顯示板顯示了歸一化后的熔解曲線和不同屏幕截圖。此外，從分組情況可以看出，屏幕上左方的盒子的紅蘭灰顏色在1-6列和7-12列是重復(fù)的模式。在這個資料組校準前得到的靈敏度是92%，校準后得到的靈敏度是100%。

校準降低Tm值對反應(yīng)量的依賴性

Tm值依靠反應(yīng)量預(yù)測，因為在反應(yīng)板中更多的Mastermix或礦物油將阻礙熱量的傳遞。這將提高顯示的Tm值。我們使用OTC小片段測試Tm值對Mastermix反應(yīng)體積的依賴。從7.0 μL到12.5 μL，以0.5 μL遞增（廠家推薦為10μL）。Tm值對反應(yīng)量的依賴性在校準前是很大的（slop=+0.069，R2=0.078），但在校準后（slope=-0.001，R2=0.066）,見圖4。校準可以有效降低量對Tm值的影響。

圖4.校準前后Mastermix體積對Tm值的影響。擴增OTC基因的47個樣品評估C.299-8T＞A突變。該反應(yīng)添加1 μL DNA模板，采用7.5 1 μL到12.5 1 μL以0.5 μL遞增的Mastermix。A板顯示的是校準前重要突變的熔解圖。B板顯示的是校準后減少的突變。C板顯示的是35T/T純合子樣品校準前Tm值對Mastermix的量依賴性。校準后可觀察到兩種情況：1）誤差線將壓縮，突變顯示減少2）斜率和R2值將大大減少，說明Tm值和Mastermix的量關(guān)系不大。對于每個反應(yīng)在板子的不同方位分布，是為了降低Tm值對樣品位置的依賴。

結(jié)論

小片段熔解是一種簡單的基因分型方法，它不需要對樣品進行PCR后處理。盡管較小的片段能夠很好的進行基因分型。但是，沒有溫度內(nèi)標的純合子基因分析的成功不僅取決于高分辨率的數(shù)據(jù)采集，而且取決于樣品間buffer、體積和提取的均一性。有效的校準可以消除這些混合因素的變化，以便于更好的相對穩(wěn)定的進行純合子基因分型。

參考文獻
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