高分辨熔解曲線突變檢測(cè)

 

高分辨熔解曲線（High Resolution Melting）技術(shù)是近年來(lái)興起的一種全新的突變掃描和基因分型的遺傳分析方法。HRM不受突變堿基位點(diǎn)與類型局限，無(wú)需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨熔解，即可完成對(duì)樣品的分析。該方法與其他遺傳分型技術(shù)相比具有靈敏度高、特異性好、成本低廉、高通量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，是進(jìn)行突變檢測(cè)的迅速、廉價(jià)而有效的方法。

HRM是在PCR基礎(chǔ)上通過測(cè)定DNA雙鏈熔解曲線變化來(lái)檢測(cè)突變的方法，溶解曲線的變化取決于DNA序列、長(zhǎng)度、GC含量，因此，可以通過飽和燃料監(jiān)控熔解曲線的變化來(lái)反映核酸性質(zhì)的差異，從而對(duì)樣品進(jìn)行分析。

在雙鏈體的溶解曲線檢測(cè)時(shí)需要添加合適的染料，飽和染料例如SYBR Green在雙鏈解鏈過程中會(huì)發(fā)生重排，無(wú)法真實(shí)反映DNA熔解情況。不適用于需低溫解鏈的樣品而且不能檢測(cè)異源雙鏈體。因此不能用于熔解曲線的檢測(cè)。而LC Green是一種與DNA有更強(qiáng)的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)PCR抑制作用很小的飽和染料，已成功的用于HRM檢測(cè)中。

HRM操作簡(jiǎn)便，在PCR結(jié)束后添加合適的染料，通過監(jiān)測(cè)升溫過程中熒光染料與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況來(lái)實(shí)現(xiàn)的，在升溫過程中，雙鏈解開，熒光染料從解鏈的分子上釋放，同時(shí)熒光強(qiáng)度降低，所以通過熒光強(qiáng)度和曲線的變化上就可以判斷是否存在突變。

 

圖一：同源雙鏈體和異源雙鏈體的熔解曲線

 

圖二：HRM數(shù)據(jù)處理過程

 

HRM應(yīng)用：

HRM特點(diǎn)：

 

HRM：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中需要考慮的問題

 

HRM靈敏度高、特異性好

該方法是在封閉的試管內(nèi)進(jìn)行，可降低污染，因此，該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉、時(shí)間少、誤差小、高通量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。是進(jìn)行突變掃描的首選方法。