數(shù)字PCR和HRM在腫瘤樣本中的應(yīng)用

數(shù)字PCR和高分辨率熔解法在腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)微量突變體的應(yīng)用

摘要：

Vogelstein和Kinzler（美國國家科學(xué)院院刊，1999年）第一次描述了Digital PCR（dPCR）的概念，一種在微量細(xì)胞群中（如原發(fā)性腫瘤組織）鑒定突變的方法。通過稀釋樣品DNA到一個單個分子水平，它可以把PCR自然模擬指數(shù)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號。當(dāng)PCR成功的擴增出這些單個分子,產(chǎn)物可以通過對觀察到的預(yù)期的體細(xì)胞純合突變峰進(jìn)行測序分析，而不是典型測序反應(yīng)中的被遮蓋在背景雜峰中的少量低峰。通過擴增足夠多的單個分子的擴增產(chǎn)物, 基于觀察到的突變體與全部的成功擴增產(chǎn)物的比，微量突變體可以被鑒定出。

方法：

我們采用一種加入HRM使用的改良dPCR方法，通過特殊的HRM曲線圖在原發(fā)性腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)低含量的突變部分。
數(shù)字PCR要求以單個DNA分子作為擴增模板，從而使末端檢測變?yōu)閿?shù)字讀出而不是模擬的DNA混合物。為了應(yīng)用HRM，需要獲得更多的擴增產(chǎn)物，來得到更加可靠的HRM曲線圖組，因此我們選擇了五不同的稀釋濃度。
這些稀釋樣本是基于后續(xù)的靈敏度接近于20%的測序手段去檢測微量突變體. HRM表現(xiàn)出高敏感性,下至2-5%的突變體都可被檢出。因此，一個單一突變基因的復(fù)制足以在溶解曲線圖中發(fā)現(xiàn)他們的差異.
檢測14種不同癌癥基因，17個樣本表現(xiàn)出存在可能的微量突變體（12）或已知突變（5）。（見表1）

對于已知突變的樣本，建立了含有5％，2.5％和1.25％的微量等位基因的混合物。所有的樣本都進(jìn)行了目標(biāo)濃度為5，10，20和40份拷貝的稀釋，擴增循環(huán)數(shù)24。
在高分辨率熔解曲線分析中排除沒有理想擴增產(chǎn)物的樣品。挑選出顯示可能有突變的稀釋樣品進(jìn)行測序。圖1 說明了這種dPCR方法中應(yīng)用HRM的工作流程。

結(jié)果：

12個腫瘤樣本中的9個被確定存在微量突變體。而所有的5個已知突變的樣本全部成功的在1.25%稀釋濃度下被鑒定出來。圖2說明了“有效”的濃度可以通過應(yīng)用表2的概率估計。

在5份拷貝這個稀釋度中存在6個擴增失敗，建議有效地稀釋濃度接近1-1.5倍（3-4.5pg）。

圖5a和5b顯示已知的BRAFx15突變分別稀釋在20和40的拷貝數(shù)。等位基因分?jǐn)?shù)反映，測序方法與稀釋度很好的對應(yīng)起來。

結(jié)論：

這些結(jié)果顯示了與傳統(tǒng)dPCR相比，如何利用HRM預(yù)檢改良dPCR方法，顯著的降低后續(xù)測序階段的工作來發(fā)現(xiàn)微量突變體。
在這項研究中，鑒定候選的HRM曲線比傳統(tǒng)的所有模板重測序的方法減少了90%的工作量。