利用微細(xì)管蛋白結(jié)晶系統(tǒng)(MPCS)進(jìn)行蛋白質(zhì)晶體生長的納升體積優(yōu)化

Cory J. Gerdts,a,b,c Glenn L. Stahl,a Alberto Napuli,d,e Bart Staker,a,d Jan Abendroth,a,d Thomas E. Edwards,a,d Peter Myler,d,f Wesley Van Voorhis,e Peter Nollertb and Lance J. Stewarta,b,c,d*

MPCS采用基于液滴的微流芯片結(jié)晶技術(shù)，可以產(chǎn)生納升體積的用于X射線衍射的蛋白質(zhì)結(jié)晶體。本研究中，使用傳統(tǒng)的氣象擴(kuò)散試驗(yàn)獲得的29個蛋白結(jié)晶，利用MPCS技術(shù)的化學(xué)梯度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)后有28（93%）個成功結(jié)晶�？傆�(jì)，通過氣象擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)中120中蛋白/沉淀劑組合得到的結(jié)晶采集數(shù)使用MPCS技術(shù)有90（75%）可以成功結(jié)晶。獲得的許多結(jié)晶體都有高質(zhì)量的X射線衍射數(shù)據(jù)，而且報(bào)道了從MPCS CrystalCards收獲的6個新蛋白結(jié)構(gòu)。

引言

提高蛋白結(jié)晶成功率的重點(diǎn)在于新技術(shù)的繼續(xù)研究和開發(fā)(Fox et al., 2008; Ng, Clark et al., 2008; Ng, Stevens & Kuhn, 2008; Li et al., 2009, 2010; Hansen et al., 2002; Cherezov et al., 2008, 2009; Dhouib et al., 2009; Sauter et al.,2007; Hansen & Quake, 2003)。蛋白質(zhì)結(jié)晶體通常很難得到，所以檢晶器要嘗試使用新的結(jié)晶技術(shù)，即使是只會使結(jié)晶成功率有很小的提高。然而，如果能夠證實(shí)檢晶器的價值，這種新技術(shù)也會被廣泛的接受。在這一領(lǐng)域里，檢晶儀價值的衡量主要通過如何用有限的蛋白量來產(chǎn)生高質(zhì)量的用于衍射的結(jié)晶體和結(jié)晶體結(jié)構(gòu)。

ATCG3D （The Accelerated Technologies Center for Gene to 3D Structures）開發(fā)了MPCS，他是一項(xiàng)基于液滴的微流體芯片蛋白結(jié)晶技術(shù)，該技術(shù)能夠快速而輕松的建立數(shù)以百計(jì)的batch-under-oil-style結(jié)晶 (Gerdts et al., 2008)。MPCS技術(shù)獨(dú)特，因?yàn)樗�能夠產(chǎn)生數(shù)以百計(jì)的納升體積（10-20nL）的結(jié)晶，每一個都包含不同的化學(xué)成分（Gerdts et al., 2006; Zheng et al., 2003, 2005）。由于結(jié)果是在芯片上形式，所以能夠很好的控制一系列的液滴濃度梯度，這可以有效的優(yōu)化蛋白質(zhì)結(jié)晶體。此外，peel-apart CrystalCards做為MPCS的一部分，主要用于衍射實(shí)驗(yàn)前簡單的結(jié)晶提取。結(jié)合這些優(yōu)勢產(chǎn)生的該項(xiàng)技術(shù)能夠詳細(xì)的優(yōu)化結(jié)晶體采樣數(shù)，并且產(chǎn)生的結(jié)晶可以直接用于下游的衍射實(shí)驗(yàn)。本研究中我們使用SSGCID提供的29個不同的可溶性蛋白檢測了MPCS技術(shù)對于結(jié)晶體優(yōu)化的能力。

2.研究工作流程

SSGCID是美國國家免疫與傳染病研究所（NIAID）資助的兩個中心之一，也是四個西北太平洋機(jī)構(gòu)的財(cái)團(tuán) (Seattle BioMed,Emerald, University of Washington and Battelle)，SSGCID的主要任務(wù)是每年確定75-100個新蛋白結(jié)構(gòu)，用于研究NIAID類別中A-C的目標(biāo)以及新出現(xiàn)的和五年期重新出現(xiàn)的傳染病生物。本研究中,SSGCID蛋白質(zhì)用于檢測MPCS使用傳統(tǒng)的氣象擴(kuò)散法中懸滴法實(shí)驗(yàn)中快速優(yōu)化蛋白結(jié)晶條件的能力。圖1顯示了研究工作流程。純化的SSGCID蛋白使用氣象擴(kuò)散法中的懸滴法篩選，與一系列常見的結(jié)晶篩選對比(Wizard I, Wizard II,Wizard III, JCSG+ and Precipitant Synergy from Emerald BioSystems, and Crystal Screen HT and Index HT from Hampton Research)。將起初沒有得到結(jié)晶的去除—與高通量SSGCID結(jié)構(gòu)測定的工作流程是一致的。如果首次篩選的單晶可以用于X射線衍射，在使用MPCS優(yōu)化前要首先檢測衍射質(zhì)量（這樣做是為了避免在結(jié)晶體優(yōu)化時做任何的改善）。蛋白產(chǎn)生的最初的微晶體或單晶不能產(chǎn)生高質(zhì)量的X射線衍射要使用MPCS優(yōu)化。因此，本研究中的蛋白檢測最初產(chǎn)生結(jié)晶采樣數(shù)但是在其他方面要隨機(jī)選擇。總之，29種蛋白質(zhì)都要經(jīng)過MPCS優(yōu)化。

圖1：本研究工作流程圖。得到純化的蛋白并且通過氣象擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)的懸滴法進(jìn)行初步的篩選。如果最初得到的結(jié)晶體是單晶而且可以收獲，那么可以進(jìn)行X射線衍射分析。如果最初的蛋白質(zhì)結(jié)晶體可以產(chǎn)生高質(zhì)量的X射線衍射數(shù)據(jù)則可以不用MPCS優(yōu)化得到蛋白結(jié)構(gòu)。但是，如果最初的X射線衍射數(shù)據(jù)不好或者是最初的蛋白質(zhì)結(jié)晶體很小或不能收獲，則需要進(jìn)行MPCS優(yōu)化。

MPCS優(yōu)化實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的高粒度梯度包含多達(dá)400個單獨(dú)的結(jié)晶在20nL的滴狀物被稱為液滴。大約2µL的剩余蛋白和2µL的沉淀劑溶液（用于初篩）在MPCS CrystalCard內(nèi)結(jié)合（圖2a）。與之前或之后的液滴相比每一個液滴形成的濃度都有輕微的不同。這可以通過動力學(xué)控制液滴形成溶液的流量來完成。計(jì)算機(jī)的流量控制產(chǎn)生了各種潛在的梯度。簡單來說,只有兩種梯度應(yīng)用于該研究中。這兩種類型顯示于圖2（b）和2（c）。兩種MPCS優(yōu)化類型的目標(biāo)是仔細(xì)詢問結(jié)晶相空間狹小區(qū)域周圍的最初的沖擊。1型優(yōu)化保持所有液滴的蛋白濃度而要改變沉淀劑的濃度。2型優(yōu)化使用不同的蛋白質(zhì)和沉淀劑濃度，另一面為了檢測不同比例的蛋白質(zhì)和沉淀劑的效果。完成優(yōu)化實(shí)驗(yàn)儲存在CrystalCard上，濕度保持在100%用于晶體生長。100%濕度條件下在CrystalCard儲存的結(jié)晶體液滴可以穩(wěn)定的保存6個月。此外，盡管在本研究中沒有繼續(xù)研究—在CrystalCard上進(jìn)行結(jié)晶生長期間通過控制存儲器濕度液滴能自動脫水。晶體生長后，用于X射線衍射分析，通過剝?nèi)ケ〉乃芰险澈蠈樱▓D2d）并且直接從微細(xì)管中收獲蛋白質(zhì)結(jié)晶體（圖2e）。

圖2：（a）最初實(shí)驗(yàn)（左）剩余的約2µL的剩余蛋白和2µL的沉淀劑溶液用于MPCS CrystalCard（右）的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。在CrystalCard上，水溶液（蛋白、沉淀劑和buffer）結(jié)合并通過惰性的、不能混合的傳遞液自發(fā)的形成獨(dú)立的液滴。結(jié)果，液滴會充滿微細(xì)管然后用于單獨(dú)的結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。比例尺=400µm。（b）,（c）蛋白結(jié)晶相圖，說明在MPCS優(yōu)化中結(jié)晶相空間如何形成，1型MPCS優(yōu)化中（b）蛋白濃度保持不變而沉淀劑形成一系列濃度梯度。2型MPCS優(yōu)化中（c）蛋白濃度開始時高隨后緩慢的減小而沉淀劑濃度起初低隨后緩慢增加，從而產(chǎn)生了一系列液滴的蛋白和沉淀劑的動力學(xué)梯度。（d）CrystalCard圖片，粘合層被剝離從而使結(jié)晶體暴露。比例尺=1inch≈2.54cm。（e）使用0.2mm的cryo-loop從CrystalCard上收獲蛋白結(jié)晶。比例尺=200µm。

3.材料和方法

塑料CrystalCard由烯烴共聚物制成。每一個CrystalCard有兩個分開的微細(xì)管大約有10µL體積。每一個微細(xì)管都可以完成一個優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。CrystalCard中液滴的形成要求低表面能的表面。這樣可以確保傳遞液(FC-40)優(yōu)先浸濕微細(xì)管壁。為準(zhǔn)備液滴形成的微細(xì)管表面，Cytonix PFC 502AFA溶液用于涂抹微細(xì)管內(nèi)部。使用涂層，CrystalCard通過Cytonix 502AFA入口充滿，而且能在室溫下儲存0.5到1小時。通過真空從CrystalCard去除502AFA溶液，緊接著在333–343 K固化1小時。

CrystalCard有四個液體進(jìn)去口，依次為傳遞液（1），蛋白質(zhì)（2），沉淀劑（3）和緩沖液（4）。緩沖液，蛋白和沉淀劑進(jìn)入通道合并為3 + 1 mixer，這里水溶液相結(jié)合，并分割成單個液滴的惰性和不混溶流體載體。注射器和聚四氟乙烯管被傳遞液回填，需要的水溶液都從聚四氟乙烯套管末端吸入。通過聚四氟乙烯管和一個聚丙烯連接器完成CrystalCard連接，形成一個密封的CrystalCard口。實(shí)驗(yàn)的組成液體安置在帶有注射器泵的聚四氟乙烯管，通過以前使用的MicroPlugger泵控制軟件在一定程度上傳遞到CrystalCard(Gerdts et al., 2008)。CrystalCard上的液體配置顯示在圖2。

水溶液的流動速率可以改變，這樣可以有一系列梯度的液滴的生成。本研究中，我們首次使用兩種類型的梯度（表1和圖3）。1型梯度中，蛋白質(zhì)以恒定的速率(2µL min-1)傳送盡管沉淀劑和緩沖液形成線性梯度（總的沉淀劑和緩沖液流量保持恒定2µL min-1）。對于大多數(shù)1型梯度，沉淀劑的流量開始時設(shè)定為2µL min-1，隨后流量慢慢的減小，緩沖液以相同的數(shù)率緩慢的增加。因此在所有的1型實(shí)驗(yàn)中，蛋白濃度保持恒定只改變沉淀劑的濃度（表1）。在梯度2型中，在蛋白和沉淀劑之間產(chǎn)生動態(tài)梯度。在梯度2型中，蛋白流量緩慢減少，沉淀劑流量緩慢增加，緩沖液流量保持恒定（表1）�？偟膩碚f，1型梯度首先產(chǎn)生蛋白/沉淀劑組合，如果沒有結(jié)晶體篩選，2型梯度通常緊接著產(chǎn)生。

表1：本研究中使用的1型和2型MPCS梯度流量表（µL min-1)

圖3：通過MPCS優(yōu)化產(chǎn)生的結(jié)晶體獲得的高質(zhì)量的數(shù)據(jù)集(2.5 A °或更好)和/或新的蛋白結(jié)構(gòu)。液滴下市對應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)圖（數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表2）。所有的比例尺=200µm。（a）從Mycobacterium tuberculosis得到的Enoyl-CoA水合酶（1.8 A ° ; PDB code 3h81);（b）Bartonella henselae中的得到的醛脫氫酶（2.1 A ° ; PDB code 3i44;通過坐滴法優(yōu)化產(chǎn)生的2.0 A °的編碼3i44的結(jié)構(gòu)已存入PDB數(shù)據(jù)庫，2.1 A °分辨率的數(shù)據(jù)集是由MPCS結(jié)晶優(yōu)化產(chǎn)生的）；（c）從Burkholderia pseudomallei得到的蛋氨酸-R-亞砜還原酶（1.7 A ° ; PDB code 3cxk）；（d）Brucella melitensis中得到的甲基異檸檬酸裂解酶（2.9 A ° ; PDB code 3eoo);（e）Babesia bovis中得到的二氫葉酸還原酶/胸苷酸合成酶(2.5 A ° ; PDB code 3i3r);（f）Bartonella henselae中得到的tRNA 鳥嘌呤-n1-轉(zhuǎn)甲基酶（2.5 A ° ; PDB code 3ief);（g）商品化的MPCS Plug Maker圖片。左：用戶界面和CrystalCard成像的觸摸屏。右：儀器樣品臺用于載入CrystalCard和結(jié)晶樣品。

本研究中使用的沉淀劑可以從Emerald Biosystems(Wizard I, Wizard II, Wizard III, JCSG+ and Precipitant Synergy)或Hampton Research(Crystal Screen HT and Index HT)得到。用戶指定的Wizard I和Wizard II也可以使用。Wizard I和Wizard II主要沉淀劑濃度增加50-100%。

CrystalCard中直接提取的結(jié)晶體可以直接用于下游的X射線衍射分析（圖2d）。100µm厚的粘合層剝離后為了暴露理想的結(jié)晶體用于收獲。通常吸取大約1微升的事先準(zhǔn)備的冷凍保護(hù)劑在理想的結(jié)晶體上。之后結(jié)晶體使用傳統(tǒng)的尼龍冷環(huán)玻璃化法從微細(xì)管中拿出，（約2毫米直徑，Hampton Research)，儲存于液氮中用于X射線分析。在個別情況下，結(jié)晶體被發(fā)現(xiàn)在100µm的連接層。在這種情況下，結(jié)晶體被冷凍保護(hù)劑覆蓋并且從塑料層頂部收獲。

4.結(jié)果

MPCS梯度在優(yōu)化氣象擴(kuò)散結(jié)晶采樣數(shù)時有很高的成功率。通過MPCS優(yōu)化的29種蛋白中，有28種（93%）使用MPCS優(yōu)化后結(jié)晶。本研究中使用的許多蛋白在最初的篩選中使用多于一種沉淀劑溶液�？傊�，120種不同的蛋白/沉淀劑結(jié)晶組合在氣象擴(kuò)散法中產(chǎn)生。在這120種組合中，MPCS優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的90（75%）的結(jié)晶—結(jié)晶的成功率很高，許多最初的結(jié)晶體不是單晶，但是微晶或沉淀物看起來像是結(jié)晶體（圖1）。此外，MPCS實(shí)驗(yàn)體積明顯減�。�50-100倍）同時從氣象擴(kuò)散法得到的結(jié)晶體轉(zhuǎn)變?yōu)閎atch-under-oil-style結(jié)晶。再次，在氣象擴(kuò)散法中不能產(chǎn)生結(jié)晶的10種沉淀劑溶液被用于MPCS優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中能夠產(chǎn)生結(jié)晶體。這些特殊的沉淀劑用MPCS進(jìn)行了測試（盡管用氣象擴(kuò)散法不能產(chǎn)生結(jié)晶體），因?yàn)樗麄兒推渌�的能夠在氣象擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生結(jié)晶體的沉淀劑溶液具有相似的化學(xué)成分�？偟膩碚f，使用這種方法測試了17種沉淀劑溶液，有十種可以產(chǎn)生結(jié)晶體（59%）。這表明，利用MPCS在標(biāo)準(zhǔn)結(jié)晶體篩選中優(yōu)化每一種沉淀劑可能會產(chǎn)生許多特殊的結(jié)晶體采集數(shù)，這些采集數(shù)可能會在單一的氣象擴(kuò)散試驗(yàn)中失敗—與batch-under-oil-style結(jié)晶的氣象擴(kuò)散相比于先前報(bào)道的數(shù)據(jù)一致(Baldock et al., 1996;D’Arcy et al., 2003)。超過90%的沉淀劑溶液用氣象擴(kuò)散試驗(yàn)檢測的用MPCS不用檢測，這表明，利用MPCS有潛在的發(fā)現(xiàn)新的結(jié)晶體采集數(shù)的能力。本研究中使用了各種各樣的沉淀劑溶液，包括各種鹽溶液，低pH（4.5）到高pH（10.5）溶液，高粘度聚乙二醇溶液和有機(jī)物如異丙醇和2-甲基-2,4-戊二醇。