基于液滴的納升體積的微細(xì)管蛋白結(jié)晶系統(tǒng)（MPCS）
Cory J. Gerdts, Mark Elliott, Scott Lovell, Mark B. Mixon, Alberto J. Napuli, Bart L. Staker, Peter Nollert and Lance Stewart
MPCS是一項全新的半自動基于液滴的結(jié)晶技術(shù)，他可以在塑料器皿中達(dá)到納升體積的結(jié)晶條件篩選，并且結(jié)晶體容易收獲從而用于傳統(tǒng)的冷凍和X射線衍射數(shù)據(jù)的收集。在這種塑料器皿中生長的蛋白質(zhì)晶體可以直接進(jìn)行下游的原位x射線衍射分析研究。MPCS能夠整合結(jié)晶混合液用于結(jié)晶化實(shí)驗。在微流控聚四氟乙烯管或塑料CrystalCard上大約會產(chǎn)生10-20nL液滴，每一個代表一批實(shí)用不同化學(xué)組分的結(jié)晶實(shí)驗。結(jié)晶實(shí)驗中所有的蛋白樣品全部使用。在一個完整的混合（‘hybrid’）結(jié)晶實(shí)驗中會聯(lián)合使用稀疏矩陣篩選和化學(xué)梯度篩選。該技術(shù)有助于使用高粒度梯度篩選優(yōu)化，使用優(yōu)化試劑如沉淀劑，配合體或冷凍保護(hù)劑。
引言
結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域每年都會產(chǎn)生增加吞吐量和效率的新技術(shù)。這樣的發(fā)展最初的目標(biāo)是從基因到三維結(jié)構(gòu)只需三天。為了提高效率，人們可能希望盡量減少所需的蛋白量，這樣可以從無細(xì)胞合成種得到充足的材料用于結(jié)晶篩選和優(yōu)化。正因為'three-day”結(jié)構(gòu)的目標(biāo)，ATCG3D致力于發(fā)展多種技術(shù)來增加基因到結(jié)構(gòu)的效率，包括合成基因設(shè)計(Gene Composer; http://www.genecomposer.net/)，蛋白質(zhì)晶體成像(DETECT-X; Emerald BioSystems)
和微流控納升體積結(jié)晶 (The Microcapillary Protein Crystallization System; MPCS)。這里，我們第一次描述了MPCS的工作原型，它由微量調(diào)節(jié)注射器泵系統(tǒng)，泵系統(tǒng)的相關(guān)軟件（(MicroPlugger)和塑料的CrystalCards組成，CrystalCards包括‘3+1 mixer’(這里進(jìn)行試劑的結(jié)合)和微流體通道（結(jié)晶體存儲）。CrystalCards的制造材料能夠使X射線傳輸光學(xué)清晰，塑模性能和耐化學(xué)腐蝕性能和表面能量的平衡。該系統(tǒng)可以生產(chǎn)用于衍射的結(jié)晶體，可以從CrystalCards收獲結(jié)晶體或使用CrystalCards上的樣品衍射數(shù)據(jù)進(jìn)行原位X射線衍射和結(jié)構(gòu)溶解。
2.背景
我們這里討論的微流納升結(jié)晶技術(shù)發(fā)展于芝加哥大學(xué)(ATCG3D- Ismagilov合作實(shí)驗室)。水溶液滴，這里叫做液滴（plug），微水相結(jié)合的形式，自發(fā)的流出與生物惰性碳氟化合物溶液不相溶 (Song et al., 2003; Tice et al., 2003, 2004)。蛋白質(zhì)、緩沖液和沉淀劑是通過三個獨(dú)立的單一通道同時流出，這里通過控制不溶的和生物惰性氟碳化合物的流量打破了水流相形成10-20nL的微配液形式的結(jié)晶 (圖1a; Zheng et al., 2003; Zheng, Tice, Roach et al., 2004)。這個區(qū)域的水流稱為‘3+1 mixer’。10-20nL的結(jié)晶體液滴在‘3+1 mixer’中形成，同時進(jìn)行結(jié)晶體培養(yǎng)和檢測（圖1b）。通過控制流量，產(chǎn)生一系列很好的濃度梯度的液滴（圖1c），允許檢測儀仔細(xì)探測結(jié)晶相空間用于結(jié)晶體優(yōu)化。基于液滴的結(jié)晶體允許使用預(yù)先形成的液滴進(jìn)行稀疏矩陣篩選（Zheng & Ismagilov, 2005; Zheng, Tice & Ismagilov, 2004），通過芯片上形成的液滴混合物和結(jié)合稀疏矩陣和梯度篩選叫做‘hybrid method’ （Li et al., 2006)形成適宜的濃度梯度（Zheng et al., 2003)。后者,可以在一個單獨(dú)的結(jié)晶實(shí)驗中全面的篩選結(jié)晶相空間。基于液滴的微流結(jié)晶也被用于探索蛋白結(jié)晶晶核形成（Chen et al.,2005; Zheng et al., 2005; Gerdts et al., 2006）和新蛋白結(jié)構(gòu)的結(jié)晶產(chǎn)生的科學(xué)問題（erdts et al., 2006)。
圖1：使用MPCS的基于液滴的蛋白結(jié)晶。（a）結(jié)晶實(shí)驗中在CrystalCard上形成的液滴。（b）MPCS CrystalCard上著色的結(jié)晶體。（c）使用low-pH buffer，high- pH buffer和universal pH buffer指示劑在CrystalCard通道（左）形成的pH梯度（右）。
3.MPCS
作為一個技術(shù)開發(fā)中心，ATCG3D開發(fā)微細(xì)管蛋白質(zhì)結(jié)晶系統(tǒng)（MPCS）是為了發(fā)展一種基于液滴的蛋白結(jié)晶技術(shù)應(yīng)用于科學(xué)研究。這個MPCS儀器主要由三個部分組成（圖2）：（1）一個泵系統(tǒng)，（2）MicroPlugger軟件和（3）CrystalCard。泵系統(tǒng)是一個四通道注射泵系統(tǒng)，可以提供精確的和連續(xù)的液流流入MPCS CrystalCard。該系統(tǒng)可以獨(dú)立的控制每一個通道而且可以產(chǎn)生極好的梯度。泵由MicroPlugger軟件控制（圖2b）。MicroPlugger軟件允許操作者通過四種不同的操作模式控制泵系統(tǒng)：Prime Mode (for priming the lines),Constant Mode (for constant-flow experiments), Gradient Mode (for generation of fine gradients) and Hybrid Mode (for sparse-matrix screening using the hybrid method)。這些操作模式適用于所有的MPCS實(shí)驗。第三個重要的成分是CrystalCard (Figs. 2c and 2d),這是一種微流芯片，這里水和氟溶液可以在3+1 mixer中自發(fā)形成10-20nL液滴。CrystalCard的設(shè)計是一種疏水表面，用于形成液滴并且有一條很長的微流控毛細(xì)管儲存和檢驗。用于衍射的結(jié)晶體可以通過從CrystalCard 進(jìn)行物理提取或進(jìn)行原位X射線衍射。有兩種形式的MPCS CrystalCard：一種是塑料CrystalCard，另一種是PDMS /聚四氟乙烯CrystalCard。塑料CrystalCard （圖2c）主要用于fine-gradient screening，PDMS /聚四氟乙烯CrystalCard（圖2d）主要用于hybrid screening和detergent-based的膜蛋白形式（PDMS /聚四氟乙烯CrystalCard必要的連接形式和表面屬性要兼容雜交篩選和detergent-based的結(jié)晶）。
圖2：MPCS組成。（a）MPCS系統(tǒng)組成圖。（b）MicroPlugger軟件操作模式截圖。（c）充滿著色的蛋白結(jié)晶的MPCS CrystalCard。（d）PDMS/聚四氟乙烯CrystalCard用于hybrid方法。
使用泵系統(tǒng)、軟件和CrystalCards，MPCS幾分鐘內(nèi)會產(chǎn)生數(shù)以百計的不同的MPCS結(jié)晶，避免
交叉污染,只需使用5微升的蛋白質(zhì)溶液。MPCS不浪費(fèi)寶貴的蛋白，因為系統(tǒng)中沒有蛋白體積的浪費(fèi)：蛋白樣品吸氣直接進(jìn)入聚四氟乙烯針，然后全部轉(zhuǎn)移到CrystalCard。MPCS的另一個特征是可以形成微量體積的結(jié)晶核（Gerdts et al., 2006）和控制CrystalCard存儲容器的濕度。（CrystalCards儲存于加濕容器中至少可以保持兩個月不變）。
3.1 MPCS實(shí)驗
使用MPCS microbatch-style結(jié)晶實(shí)驗形成液滴，這里蛋白質(zhì)和結(jié)晶試劑融合并且使用油（氟化合物FC40; Li et al., 2006; Yadav et al., 2005)包被培養(yǎng)。MPCS有兩種類型的結(jié)晶篩選：fine-gradient screening 和 hybrid screening。
3.3.1 Fine-gradient/optimization screening
MPCS梯度模式允許檢晶儀非常精細(xì)掃描結(jié)晶相空間。因為在MPCS實(shí)驗中水流的控制是使用MPCS泵系統(tǒng)和MicroPlugger軟件單獨(dú)控制的，而且，通過改變單獨(dú)通道的流量，很容易形成一系列液滴的濃度梯度（圖1c; Zheng et al., 2003)。盡管沉淀劑流量的減少，緩沖液流量的增加，但總的流量保持不變(雖然MicroPlugger軟件允許用戶設(shè)計一個定制的實(shí)驗來適應(yīng)他們的需求,包括改變形狀或總和的水流動速率)。使用Fine-gradient，一個特殊的蛋白質(zhì)-沉淀劑結(jié)合的結(jié)晶相空間可以仔細(xì)用于結(jié)晶優(yōu)化或繪制出從微晶體到單晶的過渡（圖3）。同樣的方法，所謂的反向篩選可以使用兩種結(jié)晶混合物促進(jìn)結(jié)晶體的形成（Stura et al., 1994）。芯片的濃度梯度可以使用沉淀劑、配合體、protein partners或保護(hù)劑。為減少用于結(jié)晶優(yōu)化的蛋白質(zhì)體積，F(xiàn)ine-gradient可以減少蛋白需要，當(dāng)需要形成不同的蛋白質(zhì)晶體復(fù)合物或DNA突變時是必需的。
圖3：應(yīng)用Fine-gradient形成的磷酸核糖焦磷酸激酶結(jié)晶相圖。從沉淀劑（左下）到微晶沉淀劑（右下）到微晶體（左中）到少量結(jié)晶體（右上）到單晶（左上）沉淀劑梯度表現(xiàn)出平穩(wěn)的過渡。
3.1.2 hybrid screening
hybrid screening結(jié)合芯片形式的稀疏矩陣篩選梯度（Li et al., 2006）。稀疏矩陣篩選是不同結(jié)晶劑組成的液滴要通過形成一個‘pre-formed cartridge’實(shí)現(xiàn)（Zheng & Ismagilov, 2005)。在MPCS hybrid screenin方法中，pre-formed cartridge包括一系列~100nL的液滴進(jìn)入3+1 mixer的一個。使用Microplugger軟件的Hybrid模型，pre-formed cartridge中每一個結(jié)晶試劑的濃度梯度通過改變預(yù)先形成的液滴和緩沖液的流量。在相同的實(shí)驗中進(jìn)行稀疏矩陣和梯度篩選時允許MPCS掃描大塊結(jié)晶相空間，每一個預(yù)先形成的結(jié)晶體液滴的不同濃度可以20-40個單獨(dú)的結(jié)晶。
4.產(chǎn)生用于衍射的結(jié)晶體
MPCS是一個低體積蛋白結(jié)晶篩選工具：他可以產(chǎn)生用于衍射的結(jié)晶體。雖然實(shí)驗體積（10-20nL；準(zhǔn)確的體積依賴于CrystalCard和流量）遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)的結(jié)晶技術(shù)。但是，10-20nL液滴包含足夠的蛋白用于結(jié)晶，已經(jīng)足夠獲得有用的X射線衍射數(shù)據(jù)。液滴中結(jié)晶沿著最長的軸生長40–200 µm（通道的尺寸為200×200µm）。因為結(jié)晶體用于衍射實(shí)驗，關(guān)鍵是要有方法獲取衍射數(shù)據(jù)，并且不需要增加實(shí)驗或阻礙另一個實(shí)驗技術(shù)。MPCS提供兩種方法用于獲得X射線衍射數(shù)據(jù)：傳統(tǒng)的冷凍結(jié)晶提取和原位衍射。
4.1從MPCS CrystalCard取出蛋白結(jié)晶
蛋白質(zhì)結(jié)晶體可以直接從MPCS CrystalCard上單獨(dú)的液滴提取。一個薄的塑料層粘合與塑料板上，包含微流電路。這一薄層有一個粘合劑，這種設(shè)計可以防止在結(jié)晶實(shí)驗中液體從CrystalCard流出，缺點(diǎn)是需要手工剝?nèi)ィ▓D4a和4b）。此外,液滴保留在塑料部分包含了微電路。薄的塑料層被剝離后，結(jié)晶體露了出來，而且理想的結(jié)晶體可以通過微小的工具如cryoloops收獲（圖4c和4d）。兩種技術(shù)可以用于移除冷凍保護(hù)的結(jié)晶體：（1）結(jié)晶體可以和cryoloop儀器取出放置在理想的冷凍保護(hù)劑中或者（2）可以吸取大約1微升冷凍保護(hù)劑在包含結(jié)晶體的液滴的頂部，這樣當(dāng)結(jié)晶體取出時他已經(jīng)沉淀在冷凍保護(hù)劑中。使用第一種技術(shù)，通過碳氟油層可以使液滴的蒸發(fā)延遲5min。使用第二種技術(shù)，液滴的蒸發(fā)延遲至少20分鐘，可樣可以有充裕的時間來提取許多結(jié)晶。
圖4:從MPCS CrystalCard上提取用于衍射的結(jié)晶體。（a）從MPCS CrystalCard剝離的薄的塑料覆蓋層圖片。（b）打開的CrystalCard，所有的結(jié)晶保存與塑料板上包含微液流電路。使用cryoloop從CrystalCard上取出結(jié)晶體。（d）在cryoloop中的結(jié)晶體。
結(jié)晶提取使用MPCS fine-gradient screening產(chǎn)生蛋氨酸-R-亞砜還原酶結(jié)晶體（圖5a）。結(jié)晶體形成的梯度篩選的濃度優(yōu)化為30%(v/v) MPD，25%(w/v) PEG 1500, 0.1 M醋酸鹽（pH4.5）。蛋白濃度為22 mg ml-1（20 mM HEPES pH 7.0,500 mM NaCl, 5% glycerol, 2 mM DTT）。結(jié)晶體的提取使用0.1-0.2mm的cryoloop，低溫冷凍（使用crystallant作為冷凍保護(hù)劑）且用于X射線衍射實(shí)驗。一個1.7 A ˚數(shù)據(jù)集在beamline SBC-CAT 19BM上獲�。ò⒇晣覍�(shí)驗室的APS（Advanced Photon Source）,隨后得到了其結(jié)構(gòu)（圖5b和5c，表1）。最后的調(diào)整和結(jié)構(gòu)因素都提交于蛋白數(shù)據(jù)庫中（PDB code 3cxk)。
圖5：蛋氨酸-R-亞砜還原酶。（a）蛋氨酸-R-亞砜還原酶結(jié)晶體圖。（b）半胱氨酸殘基和鋅離子（3ό）F0-FC OMIT輪廓圖。（c）Burkholderia pseudomallei中得到的蛋氨酸-R-亞砜還原酶NCS二聚體的連續(xù)剖面圖。黃球體代表鋅離子，球狀和棒狀體代表醋酸鹽離子。結(jié)構(gòu)提交于PDB（3cxk）。
4.2 原位X射線衍射
CrystalCard的設(shè)計允許進(jìn)行原位X射線衍射。這允許檢晶儀在改為冷凍保護(hù)之前評估結(jié)晶體的生長質(zhì)量并且進(jìn)行結(jié)晶體結(jié)構(gòu)測定的數(shù)據(jù)采集(Luft et al., 1999; McPherson, 2000; Ng et al., 2003; Yadav et al., 2005; Lunde et al., 2008)。CrystalCard在室溫下足夠透過X射線直接安裝在測角器上。此外，CrystalCard能夠順著X和y軸從多重結(jié)晶體重采集數(shù)據(jù)，用于組合產(chǎn)生的復(fù)雜數(shù)據(jù)集。CrystalCard可以旋轉(zhuǎn)75度，不會碰到橫梁。為了證實(shí)這種方法，我們在NE-CAT beamline 24ID-C（阿貢國家實(shí)驗室的APS）（圖6a）CrystalCard 上包含溶解酵素的結(jié)晶體并且在室溫下從CrystalCard上的三個結(jié)晶體收集X射線衍射數(shù)據(jù)。CrystalCard.部分分子替換的電子密度圖見圖6（b）。晶體的數(shù)據(jù)在表1中列出。
圖6：使用MPCS進(jìn)行的原位衍射。(a)MPCS CrystalCard安裝在有X射線源的測角計頭上。（b）從 MPCS CrystalCard上的三個結(jié)晶體收集的X射線衍射數(shù)據(jù)得到的部分分子替換的電子密度圖。
5.材料和方法
5.1 準(zhǔn)備塑料CrystalCard
塑料CrystalCard通過噴射模塑法(Siloam Biosciences Inc.)制作。液滴在CrystalCard中形成需要低表面能（疏水的）。這樣可以確保氟碳油優(yōu)先濕潤微細(xì)管壁。聚碳酸酯CrystalCard從廠家運(yùn)來時有高表面能（疏水的）。為使微細(xì)管表面用于液滴形成，Cytonix PFC 502AFA溶液用于涂抹微細(xì)管內(nèi)部。Cytonix PFC 502AFA粘附在聚碳酸酯表面，而且保持表面能6–10 dyn cm-1（1 dyn cm-1 = 1×10-3N m-1）。有涂層后，CrystalCard充滿Cytonix PFC 502AFA溶液，然后在冰上培養(yǎng)2小時（CrystalCard入口在高溫下容易破裂）。502AFA溶液從CrystalCard 移除時要通過34.5 kPa 真空干燥1小時。烘干后，CrystalCard在333k處理一小時后備用。
5.2 Macro-micro界面
Macro-micro界面連接注射器和CrystalCard用于MPCS正常運(yùn)轉(zhuǎn)。360µm內(nèi)徑，760µm外徑(ID/OD 360/760)的聚四氟乙烯管用于連接注射器和CrystalCard。聚四氟乙烯管的一端接到注射器針頭上，另一端接入一個760毫米內(nèi)徑硅片管道連接到塑料CrystalCard。PDMS/聚四氟乙烯CrystalCard緊密結(jié)合ID/OD 360/760聚四氟乙烯管。
5.3 準(zhǔn)備hybrid方法pre-formed cartridge(Li et al., 2006)
一個5-10cm的ID/OD 360/760聚四氟乙烯管連接50µL的注射器，另一頭是10cm的內(nèi)/外徑比為200µm/230µm（(ID/OD 200/230) 聚四氟乙烯存儲管。連接處有密封的毛細(xì)管蠟（(Hampton Research)。注射器和管充滿FC40（3M）并且注射器安有一個手動的吸液器(Stoelting No. 262M=, Wood Dale, Illinois, USA)。ID/OD 200/230聚四氟乙烯存儲毛細(xì)管末端用于第一次沉淀劑浸入而且150nL液體（15 units on the aspirator）被吸收。大約50nL氣泡（5 units on the aspirator）被吸收。
這個過程會重復(fù)，直到所有的理想的沉淀劑（多達(dá)24）全部被吸收。2µLFC40（大約200 units在吸附器上）吸入管內(nèi)，注射器置于泵上用于實(shí)驗。ID/OD 200/230聚四氟乙烯存儲毛細(xì)管包括預(yù)先形成的cartridge連接在PDMS/聚四氟乙烯CrystalCard沉淀劑入口，使用刀片剪通道插入毛細(xì)管水平位置。ID/OD 200/230聚四氟乙烯存儲毛細(xì)管插入到PDMS芯片（進(jìn)口的地方，在這一點(diǎn)變得錐形）并且使用毛細(xì)管蠟密封。
5.4 結(jié)構(gòu)測定
數(shù)據(jù)集采集于APS（Advanced Photon Source）：beamline 19BM（100K）用于蛋氨酸-R-亞砜還原酶，beamline 24-IDC（室溫）用于溶菌酶。數(shù)據(jù)在HKL-2000（(Otwinowski & Minor, 1997)上進(jìn)行整合。溶菌酶的結(jié)構(gòu),強(qiáng)度分別使用MOSFLM package采集三個數(shù)據(jù)集(Leslie, 1992)。溶菌酶和蛋氨酸-R-亞砜還原酶的結(jié)構(gòu)分別使用MOLREP(Vagin & Teplyakov, 1997)PDB entries 1iee和3cez研究模型進(jìn)行分子替換。結(jié)構(gòu)精煉使用REFMAC5(Murshudov et al., 1997)，模型構(gòu)建使用Coot(Emsley & Cowtan, 2004)。
5.5 CrystalCard X射線吸收
使用一個簡單的測試分析CrystalCard X射線吸收。為了做到這一點(diǎn)，離子束的射束電流規(guī)范化到APS環(huán)形電流（I/I0）。測定用或不用CrystalCard，波長為0.979261 A ˚時插入(12.66099 keV)。不用CrystalCard的I/I0為1.91671×10-6，用CrystalCard的I/I0為1.5511×10-6。這樣x射線的19%被CrystalCard吸收。
參考文獻(xiàn)：
[1]Chen, D. L., Gerdts, C. J. & Ismagilov, R. F. (2005). J. Am. Chem. Soc. 127, 9672–9673.
[2]Emsley, P. & Cowtan, K. (2004). Acta Cryst. D60, 2126–2132.
[3]Gerdts, C. J., Tereshko, V., Yadav, M. K., Demetieva, I., Collart, F., Joahchimiak, A., Stevens, R. C., Kuhn, P., Kossiakoff, A. & Ismagilov, R. F. (2006). Angew. Chem. Int. Ed. 45, 8156–8160.
[4]Leslie, A. G. W. (1992). Jnt CCP4/ESF–EACBM Newsl. Protein Crystallogr. 26.
[5]Li, L., Mustafi, D., Fu, Q., Tereshko, V., Chen, D. L., Tice, J. D. & Ismagilov, R. F. (2006). Proc. Natl Acad. Sci. USA, 103, 19243–19248.
[6]Luft, J., Rak, D. M. & DeTitta, G. T. (1999). J. Cryst. Growth, 196, 450–455. Lunde, C. S., Rouhani, S., Remis, J. P. & Glaeser, R. M. (2008). J. Appl. Cryst. 41, 483–486.
[7]McPherson, A. (2000). J. Appl. Cryst. 33, 397–400.
[8]Ng, J., Gavira, J. A. & Garcı′a-Ruiz, J. M. (2003). J. Struct. Biol. 142, 218–223.
[9]Otwinowski, Z. & Minor, W. (1997). Methods Enzymol. 276, 307–326.
[10]Song, H., Tice, J. D. & Ismagilov, R. F. (2003). Angew. Chem. Int. Ed. 42, 768–772.
[11]Stura, E. A., Satterthwait, A. C., Calvo, J. C., Kaslow, D. C. & Wilson, I. A. (1994). Acta Cryst. D50, 448–455.
[12]Tice, J. D., Lyon, A. D. & Ismagilov, R. F. (2004). Anal. Chim. Acta, 507, 73–77.
[13]Tice, J. D., Song, H., Lyon, A. D. & Ismagilov, R. F. (2003). Langmuir, 19, 9127–9133.
[14]Murshudov, G. N., Vagin, A. A. & Dodson, E. J. (1997). Acta Cryst. D53, 240–255.
[15]Vagin, A. & Teplyakov, A. (1997). J. Appl. Cryst. 30, 1022–1025.
[16]Yadav, M. K., Gerdts, C. J., Sanishvili, R., Smith, W. W., Roach, L. S., Ismagilov, R. F., Kuhn, P. & Stevens, R. C. (2005). J. Appl. Cryst. 38, 900–905.
[17]Zheng, B., Gerdts, C. J. & Ismagilov, R. F. (2005). Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 548–555.
[18]Zheng, B. & Ismagilov, R. F. (2005). J. Am. Chem. Soc. 17, 2520– 2523.
[19]Zheng, B., Roach, L. S. & Ismagilov, R. F. (2003). J. Am. Chem. Soc. 37, 11170–11171.
[20]Zheng, B., Tice, J. D. & Ismagilov, R. F. (2004). Adv. Mater. 16, 1365–1368.
[21]Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S. & Ismagilov, R. F. (2004). Angew.Chem. Int. Ed. 43, 2508–2511.
