數(shù)字PCR，LunaProbesTM和MAAB相結合可以檢測到低于0.01%的等位基因的突變
數(shù)字PCR，LunaProbesTM和MAAB相結合可以檢測到低于0.01%的等位基因的突變
Matt Poulson, Jason McKinney
Idaho Technology, Inc. Salt Lake City, Utah, USA
引言
低水平突變的檢測促使了許多新方法的發(fā)展。我們結合現(xiàn)有的三個技術：數(shù)字PCR，非標記探針法和MAAB（突變等位基因的偏向性擴增）（見圖1）。數(shù)字PCR（Vogelstein and Kinzler，1999）需要許多重復的樣本使模板稀釋至約1拷貝/反應。將原始的數(shù)字PCR進行一些改進后可以進行高分辨溶解曲線分析（HRM），要求模板稀釋為5個拷貝/反應 (McKinney, 2007)。這表明，如果存在突變的等位基因，一個反應中至少包括20%的等位基因并且可以檢測到異源雙鏈的存在。通常數(shù)字PCR檢測的靈敏度約為2%。并且靈敏度是可以增加的，這主要取決于重復檢測的數(shù)量。非標記探針法在PCR反應中加入3’端封閉的非標記寡核苷酸（Zhou，2005）。在使用HRM儀器時除了進行掃描之外，非標記探針增加了基因分型的功能（見圖2）。非標記探針的靈敏度大約在5%（Wall，2007）。MAAB利用非標記探針增加了穩(wěn)定性，探針與野生型等位基因完全匹配，和突變的等位基因不完全匹配，使突變的等位基因得到優(yōu)勢擴增。MAAB的靈敏度可以低于1%（McKinney，2009）。本實驗中，我們結合這三種方法來增加HRM的靈敏性和有效性。
材料和方法
苯丙氨酸羥化酶基因11外顯子（PAH×11）存在一個SNP，使用標準的非標記探針法進行檢測。兩個等位基因純合子樣品進行了鑒定。野生型和純合突變樣本的標準化濃度為15ng，然后混合進行一系列稀釋，突變的等位基因可以到0.01%。1%、0.1%和0.01%的等位基因樣本然后連續(xù)稀釋到5-100拷貝。之后，1%、0.1%和0.01%突變的等位基因使用96孔板分別采用數(shù)字PCR，數(shù)字PCR+非標記探針以及數(shù)字PCR+非標記探針+MAAB的方法進行實驗。每個實驗包括兩個重復，100%野生型和100%突變樣品每個反應15ng以及兩個不加模板的對照。MAAB和數(shù)字PCR+非標記探針+MAAB的方法使用Eppendorf Realplex4 Master Cycler Pro S (Eppendorf, Westbury, New York)，退火溫度為57℃，可以達到MAAB的條件。Eppendorf儀器的溫度轉(zhuǎn)換率可以達到6℃/s。快速的升溫速率對于完成MAAB實驗的PCR是至關重要的。在PCR退火時快速的升溫速率探針和目的區(qū)域緊密結合從而有效的阻礙了野生型等位基因引物的延伸�？焖俚纳郎厮俾室部梢詼p少野生型等位基因的擴增，探針和野生型等位基因鏈解鏈之后，在變性過程中減少了擴增WT等位基因的酶的時間。數(shù)字PCR和數(shù)字PCR+非標記探針在Bio-Rad IQ thermal cycler (Bio-Rad, Hercules, CA)上運行。退火溫度為68℃，在72℃延伸，以去除任何等位基因的偏差。樣品擴增完用LightScanner96進行溶解分析（Idaho Technology Inc., Salt Lake City)（見圖2）。
結果和討論
數(shù)字PCR每個反應使用的模板量為5ng（大約1.5copies）。數(shù)字PCR僅能對擴增峰進行分析。數(shù)字PCR在這一稀釋濃度時可以成功擴增，并且可以檢測到雜合樣本中0.1%的突變。在其他等位基因的實驗中，數(shù)字PCR不能夠檢測出樣品中任何的突變的等位基因。加上非標記探針法之后不僅可以提高數(shù)字PCR的靈敏度，而且可以檢測到每一個突變等位基因混合后的突變。數(shù)字PCR加非標記探針和MAAB的方法使突變的等位基因的檢測能力增加了，42個樣本檢測到1%的突變混合，37個樣本檢測到0.1%，43個樣本檢測到0.01%（見圖3）。盡管使用非標記探針和MAAB的數(shù)字PCR是技術上非數(shù)字化的模板拷貝數(shù)，但是仍要小于常規(guī)PCR的模板量。MAAB在高WT等位基因的背景下能夠增加檢測突變等位基因的能力。加上非標記探針的數(shù)字PCR和MAAB技術使用的模板濃度達到300pg（100copies/reaction）時突變的檢測率仍舊能夠達到0.01%（見圖4）。
結論
檢測低水平的DNA突變有許多用途。其中包括檢測致病菌耐藥性、非侵入性產(chǎn)前篩查，低水平體細胞突變以及檢測外周血治療后的一些其他疾病。結合使用數(shù)字PCR，非標記探針和MAAB后靈敏度可以增加10-100倍，而且可以通過具體的探針峰來確定突變的等位基因，可以減少測序的費用。
