飛行時間質譜儀鑒定微生物介紹
飛行時間質譜儀鑒定微生物介紹
基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜儀(MALDI-TOF)指紋圖譜法是一種微生物分類和鑒定的快速可靠的方法，可廣泛應用于臨床診斷、環(huán)境和分類研究或者食品加工質量控制中。BioTyperTM MALDI-TOF質譜儀指紋圖譜法可使研究人員在幾分鐘內就可鑒定不明細菌、酵母菌和霉菌。
微生物表達譜分析的一般工作流程是一個直線性路徑。從一個單克隆或其它生物材料開始，樣品可以在幾分鐘內被分析。每個樣本的自動譜圖獲取可以在幾秒鐘內完成，并且可以實現(xiàn)數(shù)據(jù)向專門鑒定軟件的無縫傳輸。因此這項技術可以極好的替代經(jīng)典的微生物鑒定和分類技術，它僅需要極少的樣品處理和費用。
MALDI-TOF測定
多數(shù)簡單的樣品分析從將少量生物材料直接放置到MALDI-TOF靶盤開始。初始材料可以是一個單克隆或者液體培養(yǎng)基離心的一個組分。微生物薄膜用基質(α-氰基-4-羥基肉桂酸；HCCA)覆蓋。質譜譜圖用MALDI-TOF質譜儀以線性正性模式用最大頻率(20-200Hz，依賴于儀器)獲取。譜圖的測量質量范圍是2000-20000Da。譜圖自動獲取可以用Bruker’s ‘autoExecute’軟件用激光強度的模糊控制來進行。
重復性
在很寬的條件范圍內，該方法都被證明是很穩(wěn)定的。生長培養(yǎng)基的不同組成對峰模式分布影響非常小；在從4000到12000Da的范圍內，幾乎沒有觀察到培養(yǎng)基的影響。附著在克隆上的培養(yǎng)基對峰模式?jīng)]有影響。同樣，細胞的生長狀態(tài)對峰模式也沒有影響。緩慢生長期的細胞與對數(shù)生長期、平臺期或者死亡期的細胞具有相似的模式。
此外，在標準條件下進行樣本制備和測量后，在不同的MALDI-TOF儀器上獲取的質譜譜圖具有很高的可比性。在3個不同的儀器上，對同一樣本靶測量的譜圖實際上是一致的。因此，來自于不同MALDI-TOF質譜儀的譜圖可以用來建立真實可靠的數(shù)據(jù)庫。
這種方法學驚人的重復性是建立在對穩(wěn)定表達的高豐度的蛋白質測量基礎上的，比如核糖體蛋白質。在很少出現(xiàn)代謝物的2000到20000Da質量范圍內，波譜圖也可被觀察到。與活細胞相比，細菌芽孢可以產生明顯不同的峰模式，而且這些“芽孢譜圖”也具有重復性。
軟件分析
廠家提供的分析軟件整合了鑒定與分類的處理質譜譜圖的所有功能。這些處理參數(shù)是用戶可以定義的，并且結果是一個專門的峰列表。為了鑒定未知微生物，模式匹配是通過將產生的峰列表與含有大量種屬特征的波譜庫相比較來完成的。特征波譜庫是通過對已知細菌種屬和菌株在細微差別的條件下進行的若干次測量來產生的。然后提取特征峰信息，好的平均數(shù)通過測量20個譜圖來獲得。軟件從整個譜集中自動生成峰列表并提取典型峰，這些峰出現(xiàn)在從一種屬來源的一定數(shù)量的譜圖中。
未知微生物通過它們各自的峰列表與數(shù)據(jù)庫的比較來鑒定。依據(jù)確定的質量數(shù)和它們的強度的相關性生成一個匹配值，這個值用來對結果進行排序。為了提高數(shù)據(jù)庫檢索的準確性，BioTyper可通過先進的再校準算法來校正峰質量數(shù)偏移。在峰提取之后，可以設定一個初始的可以接受的誤差窗口并得到一個想要的調節(jié)結果。軟件在可調節(jié)范圍內可以進行新的峰列表對已知峰列表的校準。因此甚至質量數(shù)偏差5000ppm的譜圖仍然可以被成功鑒定。這個功能使得BioTyper鑒定變得格外的可靠和準確。
為了減少重復，BioTyper提供了很多功能，如聚類和生成家庭樹。依據(jù)相似性分值，可以建立樹狀圖。而且，一項基于要素分析的不受監(jiān)管的多變量分析成為可能。使用計算的要素成分，多種聚類算法和可視化法都可達到。
應用
BioTyper給很多領域(例如環(huán)境研究、食品和水源控制和醫(yī)學診斷等)的傳統(tǒng)微生物實驗室鑒定提供了一個卓越的方法，其樣品制備和測量快速、穩(wěn)定和低耗費的特點使它非常適合常規(guī)和高通量應用。
這個方法對種系分類分析也十分有用。MALDI-TOF質譜儀表達譜分析可產生和經(jīng)典的16S核糖體DNA測序一樣的家庭樹，因為核糖體蛋白是高豐度且十分穩(wěn)定，所以觀察蛋白表達模式可以直接的考察DNA序列翻譯的情況。因此，確定分子質量組成的方法和多基因位點測序一樣有價值。
依據(jù)質譜表達譜模式來降低復雜微生物群落的重復性為科學研究提供新的能力(如在環(huán)境研究和生物多樣性的調查方面)。成千上萬的微生物可以通過BioTyper簡單的進行分析，然后可以作為進一步分析的基礎。初始的微生物參考譜圖集可以用來進行相互比較，冗余的可以去除。進一步分類的微生物可以與初始的參考數(shù)據(jù)集進行比較，然后去除或者加入譜圖庫來創(chuàng)建微生物多態(tài)性的概貌。
