一種快速有效的基因分型斑馬魚(yú)的方法

一種快速有效的基因分型斑馬魚(yú)的方法

       為了促進(jìn)斑馬魚(yú)的高通量的基因分型，我們開(kāi)發(fā)了一種新的技術(shù)——用高通量熔解分析（HRMA）區(qū)分野生、雜合、純合突變。這種耗時(shí)一個(gè)小時(shí)的技術(shù)不需要進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶酶切和瓊脂糖凝膠電泳的操作。此技術(shù)生成的熔解圖的敏感性高，可以檢測(cè)不明確的PCR產(chǎn)物。我們可以對(duì)斑馬魚(yú)的三種類(lèi)型的突變進(jìn)行可靠的基因分型，包括apchu745（apcmcr）和p53zy7 （p531166T ），小的缺失突變（bap28y75）及逆轉(zhuǎn)錄病毒的插入突變（wdr43hi821a）。這種技術(shù)可對(duì)單個(gè)斑馬魚(yú)胚胎及個(gè)體進(jìn)行基因分型并適用于其它類(lèi)型的生物體。Developmental Dynamics 238:3168-3174，2009©2009 Wiley-Liss，Inc。
關(guān)鍵詞：熔解曲線(xiàn)   斑馬魚(yú)  基因分型  SNP  點(diǎn)突變  插入突變

簡(jiǎn)介
       斑馬魚(yú)作為有機(jī)體遺傳模型正在成熟�？紤]到比較容易維持大量的突變線(xiàn)，且大量的魚(yú)位于每個(gè)突變線(xiàn)，大規(guī)模的基因分型需要有效的高通量的基因分型技術(shù)。突變的多種類(lèi)型導(dǎo)致斑馬魚(yú)突變，增加了基因分型的復(fù)雜性。ENU誘變劑——誘導(dǎo)斑馬魚(yú)突變的主要物質(zhì)，經(jīng)常導(dǎo)致單個(gè)堿基的突變，小的缺失插入也會(huì)發(fā)生。第二種比較普遍的方式是插入誘變，用逆轉(zhuǎn)錄病毒插入或轉(zhuǎn)座因子插入破壞基因。因此，有效的基因分型這些突變類(lèi)型的方法是必須的。
       提供一種更快、有效、令人滿(mǎn)意的基因分型方法，有100%的精確度。尋找高通量的技術(shù)/方法，去除掉比較浪費(fèi)時(shí)間的步驟。隨著擴(kuò)增基因組DNA 的PCR技術(shù)的出現(xiàn)，典型的基因分型技術(shù)包括Southern印跡法和放射性方法（RFLP和SSCP）已經(jīng)逐漸被淘汰。一些基于PCR的方法用于偶然產(chǎn)生或消除限制性?xún)?nèi)切點(diǎn)的突變。大多數(shù)方法，除了測(cè)序方法之外，需要用PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳。當(dāng)數(shù)百個(gè)或成千上萬(wàn)個(gè)樣品需要基因分型時(shí)，這項(xiàng)工作就變得浪費(fèi)時(shí)間且費(fèi)用較高。
       對(duì)于產(chǎn)生或消除一個(gè)特殊的限制性位點(diǎn)的突變而言，以PCR為基礎(chǔ)的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）是一種有用的技術(shù)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增感興趣的范圍。PCR產(chǎn)物用合適的內(nèi)切酶消化，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)消化產(chǎn)物。根據(jù)純合突變、雜合突變和純合野生型的限制形式進(jìn)行基因分型。
       衍生的酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（dsCAPS）與RFLP相似，限制的消化模式用于決定基因型。不同的是在PCR引物中引入多個(gè)錯(cuò)配，所以額外的錯(cuò)配，在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中產(chǎn)生一個(gè)特殊的限制性位點(diǎn)。接著，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)消化的PCR產(chǎn)物，再根據(jù)相應(yīng)的限制消化形式進(jìn)行基因分型。但是這技術(shù)有自身的缺點(diǎn)，不完全消化導(dǎo)致的錯(cuò)誤的基因分型（如：純合突變誤判為雜合突變）。另外，需要的限制性?xún)?nèi)切酶一般很少且很貴。
        等位基因特異性擴(kuò)增（ASA）是另外一種基于PCR的方法。進(jìn)行兩次PCR反應(yīng)，用2條不同的上游引物，其中一條對(duì)野生型等位基因特定的，另外一條是對(duì)突變特定的。在這種情況下，一條引物3’端的核苷酸與野生型的點(diǎn)突變相一致，另外一條引物3’端的核苷酸與突變的序列相一致。這種錯(cuò)配序列的擴(kuò)增和退火細(xì)節(jié)取決于這種方法的特異性。這種方法的缺點(diǎn)是，由于PCR過(guò)程中的錯(cuò)誤擴(kuò)增，造成假陽(yáng)性的情況比較復(fù)雜。
       逆轉(zhuǎn)錄病毒突變（或插入其他外源DNA序列比如說(shuō)轉(zhuǎn)座因子）根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒插入位點(diǎn)或野生型DNA的PCR擴(kuò)增的特異性來(lái)進(jìn)行基因分型。這些PCR反應(yīng)可以單獨(dú)進(jìn)行，一個(gè)反應(yīng)做野生型等位基因，另外一個(gè)做突變，也可以做多重PCR。在這種情況下，用的是同一個(gè)上游引物。兩個(gè)不同的下游引物，一條退火成逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA，另一條退火成野生型DNA。多重PCR反應(yīng)中，設(shè)計(jì)PCR引物，使野生型等位基因和突變型產(chǎn)物大小不同，在瓊脂糖凝膠電泳上可以檢測(cè)出來(lái)。如果PCR反應(yīng)成功，純合突變?cè)诃傊�糖凝膠電泳上可見(jiàn)一條突變產(chǎn)物，雜合動(dòng)物有兩個(gè)產(chǎn)物，純合野生型動(dòng)物可見(jiàn)一個(gè)野生型產(chǎn)物。這種技術(shù)非常精確，但是因?yàn)殚L(zhǎng)的PCR反應(yīng)而比較浪費(fèi)時(shí)間，另外需要瓊脂糖或其他高分辨的凝膠劑檢測(cè)。
        如果沒(méi)有提供上述技術(shù)，DNA測(cè)序也是動(dòng)物基因分型的一種選擇。在這種情況下，在感興趣范圍的側(cè)翼區(qū)設(shè)計(jì)引物，并擴(kuò)增PCR。通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序顯示個(gè)體動(dòng)物的基因型。這種分型方法避免了瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)。然而，測(cè)序所用的時(shí)間及費(fèi)用是這項(xiàng)技術(shù)的缺陷。
        高分辨率熔解曲線(xiàn)分析（HRMA）是分析PCR產(chǎn)物的齊次方法，不需要PCR反應(yīng)之后的操作。其應(yīng)用包括篩查突變、基因分型及序列匹配。主要應(yīng)用于人類(lèi)，最近報(bào)道了這些技術(shù)。
       我們開(kāi)發(fā)了一種有效、精確基因分型斑馬魚(yú)的方法，可以檢測(cè)多種類(lèi)型的突變。我們用一種快速有效，不需要瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的方法進(jìn)行了兩個(gè)堿基對(duì)的替換、一個(gè)缺失和一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒的插入的基因分型。這種方法用高分辨率熔解分析方法分離胚胎或個(gè)體魚(yú)的純合突變，雜合子及純合野生型。

結(jié)果
       為了克服現(xiàn)有基因分型技術(shù)的缺陷，需要從以下3個(gè)方面改進(jìn)：（1）去掉效率低且昂貴的限制性?xún)?nèi)切酶。（2）去掉對(duì)瓊脂糖凝膠電泳或其他PCR之后操作步驟的需要，但是保持區(qū)別非特異性產(chǎn)物的能力。（3）增加目前基因分型的速度。高分辨率熔解曲線(xiàn)分析方法符合上述3個(gè)要求。
        HRMA用的是敏感性高的成像儀器（我們實(shí)驗(yàn)用的是Lightscanner），在一定溫度范圍內(nèi)量化DNA雙鏈。通過(guò)使用一種依賴(lài)DNA的熒光化學(xué)物質(zhì)——LC Green染料來(lái)量化DNA雙鏈，此染料與雙鏈DNA緊密結(jié)合且發(fā)光。LC Green染料與其它燃料如Sybr-Green 相比，可以用于DNA的飽和濃度而不抑制PCR反應(yīng)，能夠產(chǎn)生高敏感性的熔解曲線(xiàn)。隨著樣品的加熱，不斷的檢測(cè)熒光的發(fā)射。一旦達(dá)到特定DNA飽和雙鏈的熔解溫度，可以檢測(cè)到熒光信號(hào)的劇烈下降。獲得派生的熔解曲線(xiàn)，且在y軸描述每單位（-dF/dT）熒光信號(hào)隨著橫坐標(biāo)x軸溫度的增加的的陰性改變。小的變化，甚至是單核苷酸多態(tài)性，在DNA雙鏈的熔解溫度上發(fā)生改變。在此，我們應(yīng)用HRMA方法對(duì)兩個(gè)缺失突變，一個(gè)小的缺失和一個(gè)病毒插入突變進(jìn)行分型。
        這種技術(shù)不需要限制性?xún)?nèi)切酶，瓊脂糖凝膠電泳，且因?yàn)镻CR產(chǎn)物小于60bp，整個(gè)PCR反應(yīng)及熔解分析在1小時(shí)之內(nèi)完成。另外，PCR產(chǎn)物的特異性可以由熔解曲線(xiàn)的一致性決定，比如說(shuō)，如果在PCR反應(yīng)中有污染，會(huì)顯示額外的熔解峰。提供Lightscanner軟件可在10分鐘內(nèi)自動(dòng)分析數(shù)據(jù)。

單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測(cè)
       ENU是正向遺傳學(xué)通用的誘變劑，ENU引起的最普通的突變是單個(gè)堿基對(duì)的改變，引起單核苷酸多態(tài)性，區(qū)分野生型和突變等位基因。我們區(qū)分了斑馬魚(yú)線(xiàn)的一個(gè)p53突變——p53zy7，此突變經(jīng)由ENU誘變F3正向遺傳學(xué)篩查。此突變是T→C轉(zhuǎn)化在基因的DNA結(jié)合范圍生成I166T。因?yàn)閜53zy7/zy7突變純合突變線(xiàn)是完全可見(jiàn)的且沒(méi)有形態(tài)學(xué)的不同，因此分子基因分型斑馬魚(yú)個(gè)體是必要的。首先，對(duì)包括突變的范圍進(jìn)行測(cè)序是區(qū)分基因型唯一可靠的方法。為發(fā)展一種高通量的鑒定突變的方法，HRMA開(kāi)發(fā)了針對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行基因分型的技術(shù)。我們用Lightscannrt引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)包括突變位點(diǎn)（Fig.1A）的引物。整個(gè)的PCR產(chǎn)物是39個(gè)堿基對(duì)。一般而言，PCR產(chǎn)物越小，Tm值的差異越大。但是，在點(diǎn)突變或小的缺失的情況下，Tm值的差異受序列改變的較大限制，而不是引物設(shè)計(jì)。野生型和突變DNA雙鏈的單個(gè)堿基對(duì)的不同造成野生型和突變等位基因之間的Tm值相差近1.5℃。為了檢測(cè)以上所述的情況，我們從雜合交叉的魚(yú)個(gè)體中準(zhǔn)備了48個(gè)尾部修飾的DNA樣品。根據(jù)這些樣品的PCR產(chǎn)物生成的熔解曲線(xiàn)，我們觀察到純合野生和純合突變的斑馬魚(yú)的熔解曲線(xiàn)的形狀不同（Fig.1B）。明顯的，我們的protocol參數(shù)允許評(píng)價(jià)雜合度。PCR程序結(jié)束時(shí)，加熱樣品至95℃使DNA變性，之后快速冷卻形成異源雙鏈核酸分子。因此，除了有中間的Tm（野生型和突變同源雙鏈之間是～80℃），雜合子有較低的Tm產(chǎn)物，這是因?yàn)楫愒措p鏈的不穩(wěn)定性。
用另一個(gè)錯(cuò)譯的等位基因驗(yàn)證這項(xiàng)技術(shù)，同時(shí)檢測(cè)這項(xiàng)技術(shù)是否可以有效的用于晶胚的基因分型，我們從側(cè)翼設(shè)計(jì)引物有一個(gè)T—C的錯(cuò)配突變?cè)赼pchu745（apcmcr）（Hurlstone et al., 2003)。PCR產(chǎn)物是53bp，預(yù)計(jì)純合野生型和突變之間有Tm值有1.5℃的差異（表1C）。從雜合晶胚中得到48個(gè)DNA樣品。再次進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析，結(jié)果產(chǎn)生了三種不同的溶解曲線(xiàn)（表1D）。在這種情況下，該突變等位基因有胞嘧啶核苷酸，因此，有較高的Tm值，因此，雜合樣品產(chǎn)生了一個(gè)中間的同源雙鏈峰和一個(gè)異源雙鏈峰。
 
 
Fig.1. 應(yīng)用HRMA對(duì)p53zy7（p53I166T）和apchu745（apcmcr）進(jìn)行點(diǎn)突變基因分型。A：p53I166T 錯(cuò)譯突變周?chē)�的序列。有下劃線(xiàn)的為引物序列，星號(hào)標(biāo)注的是SNP位點(diǎn)。野生型產(chǎn)物的Tm值為79.5℃，突變型為80.9℃。B：Melting curves of the PCR products from 48 tail-clip genomic DNA samples isolated from the adult progeny from a cross of p53zy7/þ heterozygotes. Following clustering analysis, the red curves denote wild-type samples, the blue curves denote mutant samples, and the black curves denote heterozygous samples.C：apchu745錯(cuò)譯突變周?chē)�的DNA序列，下劃線(xiàn)標(biāo)注的是引物序列，星型標(biāo)注的是SNP位點(diǎn)。野生型產(chǎn)物的Tm值是80.9℃，突變的為82.0℃。D：Melting curves of the PCR products from 48 embryonic DNA samples generated by crossing a apchu745/t fish to apchu745/t fish. Following clustering analysis, the red curves denote wild-type samples, the blue
curves denote mutant samples, and the black curves denote heterozygous samples.

      p53基因型（12野生型：24雜合子：12突變型）和APC基因型（11野生型：25雜合子：12突變型）符合孟德?tīng)柕?:2:1的比率。此外，通過(guò)對(duì)p53的24個(gè)樣品以及APC的24個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)序，也驗(yàn)證了HRMA的結(jié)果的準(zhǔn)確性是100%。

缺失檢測(cè)
    除了SNP的檢測(cè)，我們還想評(píng)估是否HRMA可以提供斑馬魚(yú)小缺失的基因分型。斑馬魚(yú)突變體的bap28的第2外顯子有5個(gè)堿基對(duì)的缺失（Azuma et al.,2006）。在缺失的側(cè)翼設(shè)計(jì)引物，結(jié)果產(chǎn)生46bp的野生型產(chǎn)物和41bp的突變產(chǎn)物，二者的Tm值有1.6℃的差異（表2A）。分析48個(gè)DNA樣品，每一個(gè)代表一個(gè)雜合—雜合的胚胎，產(chǎn)生了三種不同的溶解曲線(xiàn)（表2B）。在這個(gè)分析中，較少的純合突變產(chǎn)物的Tm值較低，雜合子表現(xiàn)出中間的Tm值產(chǎn)物和異源雙鏈的產(chǎn)物。和p53以及APC的基因分型相似，BAP28的基因型（12野生型：25雜合子：11純合突變）的比符合孟德?tīng)柕?:2:1的遺傳比率，而且24個(gè)不同的基因型都通過(guò)測(cè)序進(jìn)行了驗(yàn)證。

Fig.2. 通過(guò)溶解曲線(xiàn)進(jìn)行bap28突變小的缺失的基因分型。A：bap28缺失突變周?chē)�的DNA序列。下劃線(xiàn)標(biāo)注的是引物序列，虛線(xiàn)標(biāo)注的是缺失。野生型產(chǎn)物的Tm值是76.8℃，突變型為75.2℃。B：從bap28y75/+雜合子得到的48個(gè)晶胚的PCR產(chǎn)物的溶解曲線(xiàn)。聚類(lèi)后，紅色曲線(xiàn)表示野生型樣本，藍(lán)色曲線(xiàn)表示突變型樣本，黑色為雜合樣本。

轉(zhuǎn)錄病毒插入檢測(cè)
       斑馬魚(yú)的插入誘變是一種常見(jiàn)的也是一種有效的研究基因打斷的方法（Golling et al., 2002; Balciunas and Ekker,2005）。我們想設(shè)計(jì)一種方法驗(yàn)證HRMA是否可以用于斑馬魚(yú)的特異性插入的基因分型。該突變系hi821a（Amsterdam et al., 2004）在wdr43基因的第二內(nèi)含子有一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒的插入（表3A）。設(shè)計(jì)引物產(chǎn)生一個(gè)小的產(chǎn)物，用Tm值來(lái)區(qū)分野生型和突變的等位基因（表3B）。分析插入突變的引物設(shè)計(jì)比點(diǎn)突變的引物設(shè)計(jì)更加靈活；目的是設(shè)計(jì)的PCR產(chǎn)物有更大的Tm的差異。理想情況下，臨近插入位點(diǎn)的引物都可以用于PCR產(chǎn)物，盡量減小兩個(gè)產(chǎn)物的同源序列。對(duì)于hi821a等位基因，正向引物（插入位點(diǎn)在基因內(nèi)區(qū)2,50）包括突變和野生型等位基因。引物只針對(duì)野生型和插入突變?cè)O(shè)計(jì)，因此，產(chǎn)物有不同的大小和不同的溶解溫度。對(duì)于hi821a位點(diǎn)，野生型等位基因內(nèi)含子2的反向引物，在插入位點(diǎn)30，插入突變的反向引物接近逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR的50末端（表3A）。因此，純合野生型或突變都只有一個(gè)產(chǎn)物和一個(gè)Tm值（表3C）。雖然引物A和B或A和C2在理論上都能擴(kuò)增得到突變等位基因的產(chǎn)物，大片段的產(chǎn)物（7+ KB）隨著延伸時(shí)間的縮短（4sec），選擇性的擴(kuò)增各產(chǎn)物。此外，在這種情況下，較大的產(chǎn)物可能被擴(kuò)增，這一產(chǎn)物的Tm值可能會(huì)高并且易于在分析中排除。在雜合子中多有的產(chǎn)物都被擴(kuò)增。這些產(chǎn)物有截然不同的溶解溫度，三種不同的基因型很容易檢測(cè)到（表3C）。值得注意的是，在分析插入突變時(shí)一個(gè)重要的步驟是PCR反應(yīng)的最后一步?jīng)]有加熱到95℃，而且加了一步72℃的延伸以確保只形成同源雙鏈。Wdr43的基因分型（12野生型：24雜合子：12突變型）遵循孟德?tīng)柖�律。所�?4個(gè)基因型都通過(guò)PCR引物擴(kuò)增野生型等位基因（583bp）和突變等位基因（230bp），然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證。
 
Fig.3. 通過(guò)高分辨溶解曲線(xiàn)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒插入突變wdr43hi821a進(jìn)行基因分型。A：wdr43hi821a的基因組。B：野生型和突變等位基因的DNA序列。下劃線(xiàn)標(biāo)注的是引物序列。野生型的Tm值為73.0℃，突變型的Tm值為81.1℃。C：從wdr43hi821a/+得到的48個(gè)晶胚的DNA樣品的PCR產(chǎn)物的溶解曲線(xiàn)。聚類(lèi)后藍(lán)色的為野生型樣本，紅色曲線(xiàn)為突變樣本，黑色為雜合樣本。

討論
      通過(guò)高分辨溶解曲線(xiàn)（HRMA）很容易就區(qū)分出了斑馬魚(yú)中三種不同類(lèi)型的突變。與其他方法相比該技術(shù)有許多優(yōu)點(diǎn)。所用的時(shí)間和PCR所必備的程序明顯少于其他方法。PCR可以快速進(jìn)行，而且溶解曲線(xiàn)的分析要快于進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。無(wú)需使用稀有的和昂貴的限制性?xún)?nèi)切酶。PCR的有效性和特異性高，可以去除進(jìn)行下游分析的不確定性，例如進(jìn)行酶切就容易出錯(cuò)。
盡管我們?cè)诎唏R魚(yú)中應(yīng)用了該技術(shù)，HRMA還可以用于其他模式生物中。從任何生物中得到的DNA都可以進(jìn)行HRMA。大多數(shù)小鼠的基因分型都要敲除等位基因，這里也可以用HRMA這種方法進(jìn)行基因分型以及插入突變的分析。SNP/小缺失檢測(cè)的方法可以用于檢測(cè)不太頻繁的小鼠missense or floxed的等位基因。類(lèi)似于斑馬魚(yú)，線(xiàn)蟲(chóng)（C.eleagans）和(D.malanoganster)主要突變的點(diǎn)突變，小的缺失或插入。此外，本研究中描述的這種方法需要從任何生物中提取DNA。因?yàn)楦叻直嫒芙馇�線(xiàn)分析的靈敏度可以允許檢測(cè)單核苷酸的差異，因此通過(guò)掃描整個(gè)基因可以找到突變的位置。大的人類(lèi)基因例如BRCA1（van der Stoep et al., 2009）和CFTR（Montgomery et al., 2007）通過(guò)掃描的方法比測(cè)序要更有效。人類(lèi)（Liew et al., 2004）和植物（McKinney et al., 2009）的基因分型以及微生物物種分析都可以應(yīng)用。
       TILLING這項(xiàng)技術(shù)曾應(yīng)用于斑馬魚(yú)中經(jīng)過(guò)ENU誘變的特定基因的突變鑒定（Till et al., 2003）。這一技術(shù)涉及到使用稀有的，異源雙鏈分子特異性酶Cell1的酶切，來(lái)檢測(cè)不配對(duì)的DNA，隨后還要進(jìn)行凝膠切割和成像。這種方法不僅繁瑣而且需要昂貴的設(shè)備。類(lèi)似于人類(lèi)突變的掃描，其他基因也可以使用HRMA技術(shù)掃描得到可靠的結(jié)果而且要比TILLING花費(fèi)少且節(jié)省時(shí)間。
       該技術(shù)的一個(gè)限制就是要使用LightScanner。不過(guò)也可以在靈敏度較低的一起上進(jìn)行HRMA，例如Roche LightcycleVR480或Qiagen Rotor-Gene Q，只要PCR產(chǎn)物可以容納總夠的Tm值差異。此前發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示不同的儀器可以不同靈敏度下檢測(cè)PCR產(chǎn)物的溶解差異(Herrmann et al., 2006, 2007a,b; Reed et al., 2007)。HRMA的應(yīng)用范圍將繼續(xù)增加（Vossen et al., 2009）。該技術(shù)已經(jīng)成為我們實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行動(dòng)物模型基因分型最有效的方法，并且在突變掃描方面也是非常有價(jià)值的技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)方法

DNA提取
晶胚或Tail-clip放置于96孔板中，去除晶胚中的水，然后在每個(gè)孔中加入100µL的ELB（10mM TRIS pH8.3, 50mM KCl, 0.3% Tween 20, 0.3% NP40, 1 mg/mL  Prot K）,55℃培養(yǎng)4hr 至過(guò)夜，這根據(jù)樣品的大小決定。板95℃加熱15min已鈍化蛋白酶K。

PCR和溶解曲線(xiàn)分析
引物設(shè)計(jì)，HRMA可以依據(jù)不同純合擴(kuò)增子Tm值得差異來(lái)區(qū)分不同的基因型（Liew et al., 2004）。這種差異可以使用任何一種軟件包的鄰近參數(shù)來(lái)估算Tm值。除此之外，引物設(shè)計(jì)沒(méi)有特定的要求，使用任何引物設(shè)計(jì)軟件都可以。點(diǎn)突變的引物設(shè)計(jì)可以使用Lightscanner引物設(shè)計(jì)軟件（Idaho Technology）。然而對(duì)于小的缺失或插入，可以手動(dòng)設(shè)計(jì)引物，然后使用Vector NTI程序來(lái)預(yù)測(cè)產(chǎn)物的Tm值（Invitrogen）。PCR可以在MJ Research 96孔PCR儀上進(jìn)行。所有的反應(yīng)使用96孔板（BioRad HSP9665）。SNP檢測(cè)和小的缺失的PCR反應(yīng)程序是：95℃ 15sec，然后95℃ 2sec，60℃ 2sec，72℃ 2sec（40 cycles）。之后95℃ 10sec,4℃冷卻，4℃保存。逆轉(zhuǎn)錄病毒插入檢測(cè)的PCR反應(yīng)程序是：95℃ 15sec，然后95℃ 2sec，60℃ 2sec，72℃ 4sec（35cycles），隨后72℃ 30sec，4℃冷卻，4℃保存。PCR試劑：1×ExTAQ PCR buffer，1× dNTPs（250 µM each），1× LC Green Plus，0.5µM 引物，1µL 基因組DNA，0.25U ExTAQ，10µL反應(yīng)體系。PCR結(jié)束后在LightScanner上65-95℃進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析（Idaho Technology）。升溫速率為0.1℃/sec。使用LightScanner軟件進(jìn)行溶解曲線(xiàn)的歸一化后進(jìn)行分析（Wittwer et al., 2003）�；�因分型全部由軟件自動(dòng)化完成（Palais and Wittwer, 2009）。96孔板的溶解大概需要10min，基因分型不到5min。

PCR引物
• P53 FWD (F3): GCGCCTGCTGGTCA
• P53 REV (F4): CTGATTGCCCTCCACTCTT
• APC FWD (F29): CCACTAATAATGTTGCAGCTGA
• APC REV (F30): GACTGATGATTGGCTCTCAGA
• BAP28 FWD (K73): AAAGAGGTCAACAAGAAACTG
• BAP28 REV (K74): TGAGGAAGAGAGAAATGCTC
• WDR43 FWD (K51): ACAAGATTCTTAAGGGATAAAGT
• WDR43 REV (K56): GTAAATCATCATTAACATCTATTACC
• VIRUS REV (K53): GAGTGATTGACTACCCGTCAG
• WDR43 FWD (SG9): CCATCCTCATCTACAGCACACTGA
• WDR43 REV (SG112): GGGTTAATGGGACCAACTGA
• VIRUS REV (SG22): GTTCCTTGGGAGGGTCTCCTC