分子影像學(xué)與干細(xì)胞移植活體示蹤的研究進(jìn)展

作者：馮銘 王任直    作者單位：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院-中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科， 北京 100730

【摘要】  近年來(lái)，干細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血液病和心臟疾病治療中獲得廣泛應(yīng)用。干細(xì)胞移植后，活體示蹤干細(xì)胞的存活和遷徙具有重要意義。分子影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展使干細(xì)胞活體示蹤成為可能，光學(xué)成像、磁共振成像、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像是臨床和實(shí)驗(yàn)中常用的分子影像學(xué)方法，具有各自的優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)。本文即對(duì)以上成像方法在干細(xì)胞活體示蹤方面的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景予以綜述。

【關(guān)鍵詞】  分子影像學(xué) 干細(xì)胞移植 熒光抗體技術(shù)

　　干細(xì)胞是具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，對(duì)腦血管病、神經(jīng)退行性病、血液病、缺血性心肌病等有著廣闊的應(yīng)用前景。分子影像學(xué)的發(fā)展使在活體狀態(tài)下示蹤移植細(xì)胞的存活、遷徙成為現(xiàn)實(shí)。
　　     
　　Weissleder[1]于1999年提出分子影像學(xué)概念，即在細(xì)胞和分子水平活體評(píng)價(jià)生物過(guò)程，包括體內(nèi)示蹤細(xì)胞的存活、遷徙。目前，分子影像學(xué)用于干細(xì)胞活體示蹤的技術(shù)主要包括光學(xué)成像、磁共振成像、核醫(yī)學(xué)成像，后者主要包括單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像 （single photon emission computed tomography，SPECT） 和正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像 （positron emission tomography，PET）。

　　1    光學(xué)成像
       
　　檢測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)基因表達(dá)及細(xì)胞活動(dòng)的光學(xué)成像技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、直觀性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，其關(guān)鍵是設(shè)計(jì)生物相容性好的近紅外熒光染料，研制特異性影像探針，合成可激發(fā)的生物發(fā)光蛋白[2]。光學(xué)成像包括生物發(fā)光成像和熒光成像，前者利用動(dòng)物體內(nèi)的自發(fā)熒光，不需要激發(fā)光源；后者需要外界激發(fā)光源。

　　1.1    生物發(fā)光成像    生物發(fā)光技術(shù)采用熒光素酶基因標(biāo)記干細(xì)胞或DNA， 靠酶和底物的特異作用而發(fā)光。由于動(dòng)物體自身不會(huì)發(fā)光，故生物發(fā)光背景極低，從動(dòng)物體表的信號(hào)水平可直接得出發(fā)光細(xì)胞的數(shù)量。Maxwell等[3]用熒光基團(tuán)結(jié)合的氧化鐵納米顆粒標(biāo)記造血干細(xì)胞，進(jìn)行熒光成像；與流式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)合，可以評(píng)價(jià)干細(xì)胞標(biāo)記效率和歸巢能力。Rosen等[4]采用納米熒光探針標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞，植入哺乳動(dòng)物心臟，結(jié)果8周后仍可看到移植細(xì)胞。

　　1.2    熒光成像    熒光技術(shù)采用熒光報(bào)告基因，如綠色熒光蛋白 （GFP） 等熒光染料對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，報(bào)告基因、熒光染料受到激發(fā)即可產(chǎn)生熒光。熒光成像的波長(zhǎng)范圍為400～900 nm，常見(jiàn)熒光材料具有不同的波長(zhǎng)范圍可供選擇[5]。這種技術(shù)較生物發(fā)光操作簡(jiǎn)單，無(wú)需注入底物，發(fā)光強(qiáng)度高。但生物體內(nèi)許多物質(zhì)在受到激發(fā)光激發(fā)后，會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的自發(fā)熒光，以至?xí)��?yán)重影響檢測(cè)的靈敏度，特別是當(dāng)發(fā)光細(xì)胞位于組織內(nèi)部時(shí)，背景底色會(huì)很高。該技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是無(wú)輻射，可進(jìn)行連續(xù)、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，靈敏度、分辨率較高，而花費(fèi)相對(duì)較低。光的穿透能力很有限，僅為數(shù)毫米到數(shù)厘米，因此，熒光成像多用于小動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究。另外，由于散射等原因，其空間定位能力較差。

　　2    磁共振成像
       
　　MRI是最常用的成像方法，由于有效成像時(shí)間長(zhǎng)，可觀察細(xì)胞的動(dòng)態(tài)遷徙過(guò)程，空間、時(shí)間分辨率高，對(duì)比度好，因此，其前景看好。
　　     
　　MRI主要依賴縱向 （T1）、橫向 （T2） 弛豫時(shí)間及使用對(duì)比劑前后弛豫時(shí)間的差別來(lái)診斷。常用的對(duì)比劑有兩種：一種是釓類 （Gd3+），T1WI為高信號(hào)，也稱陽(yáng)性對(duì)比劑；另一種為超順磁性對(duì)比劑，如SPIO （superpara-maganetic iron oxide） 和USPIO （ultra- small superparamagnetic iron oxide），T2WI和T2*WI （對(duì)鐵顆粒敏感） 為明顯的低信號(hào)，稱陰性對(duì)比劑。Gd3+標(biāo)記的細(xì)胞只能在移植后1周內(nèi)檢測(cè)到，不能用來(lái)長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)細(xì)胞的存活及遷徙[6]。而SPIO在體內(nèi)更穩(wěn)定，也能提供更好的對(duì)比度；居勝紅等[7]采用國(guó)產(chǎn)的磁性納米粒子標(biāo)記人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得了滿意的結(jié)果。單純應(yīng)用SPIO標(biāo)記干細(xì)胞效率較低， 而通過(guò)轉(zhuǎn)染劑可顯著提高標(biāo)記效率。常用轉(zhuǎn)染劑包括魚(yú)精蛋白 （PRO）、多聚賴氨酸 （PLL）、繁枝體大分子化合物 （Dendrimer） 等；其中以陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染劑PLL應(yīng)用最多，其通過(guò)電荷吸附作用結(jié)合SPIO，可以有效地被內(nèi)涵體吞噬。菲立磁 （Feridex-PLL） 對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的活力和增殖能力無(wú)影響[8]，但可抑制干細(xì)胞向軟骨方向分化[9]，而向脂肪和骨方向的分化不受影響。
　　     
　　目前，磁共振可以檢測(cè)到很少量的細(xì)胞甚至單細(xì)胞[10]。Hoehn等[11]采用USPIO標(biāo)記大鼠胚胎干細(xì)胞，植入大鼠腦缺血對(duì)側(cè)的皮質(zhì)下及紋狀體，數(shù)天后，MRI顯示出移植細(xì)胞向缺血區(qū)域移行的路徑。魏俊吉等[12]將標(biāo)記Feridex的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 （hBMSC） 植入腦缺血大鼠的同側(cè)及對(duì)側(cè)腦實(shí)質(zhì)內(nèi)，MRI顯示移植后第14天，缺血同側(cè)移植組hBMSC向缺血灶邊緣遷移，缺血對(duì)側(cè)hBMSC沿胼胝體彌散。Ju等[13]采用SPIO標(biāo)記鼠BMSC，植入鼠肝損害模型，MRI可活體觀察到移植細(xì)胞，組織學(xué)檢查證實(shí)肝臟內(nèi)有存活的BMSC。
　　     
　　用SPIO標(biāo)記干細(xì)胞具有許多優(yōu)勢(shì)：信號(hào)對(duì)比度好，尤其在T2WI和T2*WI；對(duì)比劑由可生物降解的鐵組成，分解后參與鐵代謝，可被機(jī)體再利用；核心層外包被葡聚糖，可直接結(jié)合各種功能性基團(tuán)；很容易用光鏡或電鏡觀察到；通過(guò)改變顆粒的大小，可以調(diào)整其磁效應(yīng)。但SPIO的應(yīng)用也有一些限制：鐵顆粒會(huì)引起信號(hào)的丟失，產(chǎn)生所謂的黑洞效應(yīng)，直接影響MRI相關(guān)解剖結(jié)構(gòu)的顯示，不能區(qū)分移植細(xì)胞和人工植入物造成的磁敏感性偽影；細(xì)胞所攜帶的非遺傳物質(zhì)會(huì)逐漸減少，被排出細(xì)胞外并被其他細(xì)胞攝取。目前的研究結(jié)果表明：至少在移植后18周內(nèi)，可以通過(guò)MRI檢測(cè)到標(biāo)記的細(xì)胞[14]。

　　3   核醫(yī)學(xué)顯像
　　     
　　SPECT和PET為核素示蹤的顯像技術(shù)。PET的顯像原理決定了它較SPECT具有更高的空間分辨率和敏感性，其在神經(jīng)系統(tǒng)中應(yīng)用最廣泛[15]。SPECT掃描需要準(zhǔn)直器，只能檢測(cè)到身體發(fā)射的小部分γ-射線，影響其敏感性；另外，散射也降低了它的空間分辨率[16]。
　　     
　　各種組織或細(xì)胞均有特異或相對(duì)特異的分子標(biāo)志物，利用適當(dāng)?shù)姆派湫院怂貥?biāo)記這些特異性標(biāo)志物來(lái)作為探針，能夠在活體顯示組織、細(xì)胞的存在和狀態(tài)。根據(jù)感興趣分子與探針的不同，核醫(yī)學(xué)顯像可以分為代謝顯像、抗體顯像、受體顯像、報(bào)告基因顯像和反義顯像。

　　3.1    代謝顯像    其在臨床科研中應(yīng)用較多。最常用的分子探針是組織和細(xì)胞的代謝底物或類似物。如氟-18-脫氧葡萄糖 （18F-FDG） 是葡萄糖的類似物，被細(xì)胞攝取后在己糖激酶的作用下完成磷酸化，然后停留在細(xì)胞內(nèi)濃聚而不再參于代謝。18F-FDG掃描可反映葡萄糖的代謝情況，從而間接反映疾病的狀況[17]。Hofmann等[18]研究18F-FDG標(biāo)記的BMSC在心肌梗死病人心肌中的歸巢情況，結(jié)果在心肌梗死區(qū)域 （主要是心肌梗死邊緣） 發(fā)現(xiàn)了移植細(xì)胞。由于葡萄糖和氨基酸代謝是多通路、多分子調(diào)節(jié)的，故利用代謝顯像示蹤干細(xì)胞增殖的特異性較低。Doyle等[17]利用18F-FDG 標(biāo)記前體細(xì)胞，通過(guò)冠狀動(dòng)脈移植治療心肌梗死，利用PET或CT可動(dòng)態(tài)觀察到細(xì)胞存活情況。Stelljes等[19]利用18F-FDG-PET做為一種敏感、無(wú)創(chuàng)的檢查方法來(lái)檢測(cè)移植物抗宿主病 （GVHD）。

　　3.2    抗體顯像    抗體顯像是利用抗原、抗體的特異結(jié)合，將抗體作為探針，以檢測(cè)細(xì)胞表面抗原的存在。這一技術(shù)的關(guān)鍵是獲得同源性抗體，并構(gòu)造分子量小、呈脂溶性的抗體。

　　3.3    受體顯像    受體顯像是將放射性標(biāo)記配基引入體內(nèi)，與特異性受體結(jié)合，從而顯示受體作用的部位。受體顯像最有可能首先進(jìn)入干細(xì)胞活體示蹤領(lǐng)域。神經(jīng)受體顯像劑有相對(duì)成熟的藥物或藥物衍生物作為標(biāo)記底物。國(guó)內(nèi)研究者用11C-raclopride與D2受體結(jié)合，進(jìn)行PET顯像，在神經(jīng)前體細(xì)胞的移植部位看到了明顯的放射性濃聚[20]。

　　3.4    報(bào)告基因顯像    報(bào)告基因顯像將報(bào)告基因 （如GFP） 與靶基因耦聯(lián)，通過(guò)測(cè)定表型蛋白，間接反映靶基因的表達(dá)。一種報(bào)告基因可以與多種靶基因耦聯(lián)，一個(gè)報(bào)告基因系統(tǒng)能用于多種基因顯像。但必須在體外將報(bào)告基因與靶基因耦聯(lián)，然后用載體導(dǎo)入動(dòng)物或人體內(nèi)。

　　3.5    反義顯像    反義顯像通過(guò)螯合劑將核素與反義寡核苷酸連接，在細(xì)胞內(nèi)與靶基因的mRNA互補(bǔ)結(jié)合，從而顯像，可反映目標(biāo)DNA的轉(zhuǎn)錄情況。雖然這種技術(shù)尚未成熟，但其可能是徹底解決干細(xì)胞活體示蹤技術(shù)的最終途徑。
　　     
　　利用PET示蹤干細(xì)胞，在靈敏度、定量分析方面具有較大的優(yōu)勢(shì)，并已在干細(xì)胞移植治療帕金森病研究中獲得了很好的效果。但是，目前核醫(yī)學(xué)顯像仍不能完全解決干細(xì)胞活體示蹤的問(wèn)題，其主要原因是缺乏特異性干細(xì)胞標(biāo)記物。隨著干細(xì)胞特異性標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)及分子探針技術(shù)的發(fā)展，PET將成為最有前途的示蹤干細(xì)胞的分子影像學(xué)技術(shù)。