Affymetrix Barley 基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)小麥白粉病抗性基因Stpk-V

 

小麥?zhǔn)悄壳笆澜缟戏N植最廣泛的糧食作物，全球至少三分之一的人口以小麥為主食。而小麥白粉�。╬owdery mildew）嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量，小麥白粉病是由白粉菌（Blumeria graminis f. sp. tri1ci，Bgt）引起的世界性真菌病害，培養(yǎng)小麥白粉病抗性品種是控制白粉病的有效途徑。

 

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的陳佩度教授是小麥遺傳育種的專家，他曾將簇毛麥（Haynaldia villosa）抗白粉病基因定位于6V染色體短臂，這一染色體區(qū)段后來(lái)被命名為Pm21。簇小麥-普通小麥易位系T6VS-6AL具有持久、廣譜的白粉病抗性，這也從一個(gè)側(cè)面證明了Pm21具有穩(wěn)定的白粉病抗性功能。然而Pm21染色體區(qū)段上白粉病抗性基因的精細(xì)定位用傳統(tǒng)的分子遺傳方法卻很難實(shí)現(xiàn)，因?yàn)榇孛�麥�?VS染色體區(qū)段與普通小麥的6AS不配對(duì)。

 

在本研究中，陳佩度教授領(lǐng)導(dǎo)研究小組利用基因芯片等技術(shù)手段，克隆并鑒定出Pm21基因簇的關(guān)鍵成員——絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶基因（Serine/threonine kinase gene，Stpk-V），此基因賦予了小麥白粉病抗性。該研究成果發(fā)表在2011年的PNAS雜志上。相關(guān)的基因芯片技術(shù)服務(wù)由上海伯豪生物技術(shù)有限公司/生物芯片上海國(guó)家工程研究中心（）完成。

 

 

研究小組首先利用基因芯片（Affymetrix  Barley GeneChip）比較Bgt感染前后的簇毛麥表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)Bgt感染后，共有196個(gè)基因表達(dá)量增加了一倍，其中有131個(gè)基因具有明確的功能。在這131個(gè)基因中，研究人員發(fā)現(xiàn)了4個(gè)抗性相關(guān)基因（resistance gene analogues，RGAs），而其中只有一個(gè)基因位于簇毛麥的6VS區(qū)段，這個(gè)基因就是Stpk-V。隨后研究人員用RT-PCR的方法對(duì)基因芯片的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，并用RACE的方法獲得了Stpk-V基因的cDNA全長(zhǎng)，并用可轉(zhuǎn)化人工染色體（transforma Mon-competent arMficial chromosome，TAC）文庫(kù)的方法獲得了Stpk-V基因全長(zhǎng)，Stpk-V基因共有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。研究小組又用FISH和GISH的方法對(duì)Stpk-V進(jìn)行基因組定位，證實(shí)它確實(shí)位于6VS的FL 0.45-0.58染色體區(qū)段上，這一區(qū)段正是Pm21基因簇的位置。

 

吸器（haustorium）是真菌生長(zhǎng)過(guò)程中獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的關(guān)鍵器官，吸器指數(shù)（haustorium index）也常被用來(lái)衡量真菌的生長(zhǎng)狀況。研究小組利用瞬時(shí)表達(dá)的方法對(duì)Stpk-V對(duì)Bgt感染小麥的吸器指數(shù)進(jìn)行了研究。

如圖所示。Yangmai158小麥?zhǔn)荁gt敏感型，易位系小麥T6VS-6AL則具有Bgt抗性。當(dāng)Yangmai158瞬時(shí)表達(dá)對(duì)照基因GUS時(shí)，吸器指數(shù)高達(dá)54.8%；而Yangmai158瞬時(shí)表達(dá)GUS+Stpk-V時(shí)，吸器指數(shù)降低到13.6%。T6VS-6AL瞬時(shí)表達(dá)GUS，吸器指數(shù)為14.1%。這一結(jié)果表明，瞬時(shí)表達(dá)Stpk-V會(huì)抑制Bgt的生長(zhǎng)。

 

Bgt感染T6VS-6AL和Yangmai158，隨后用RT-PCR分析Stpk-V的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Bgt的感染能增加T6VS-6AL中Stpk-V的表達(dá)量，而Yangmai158中則檢測(cè)不到Stpk-V的表達(dá)。用病毒誘導(dǎo)的基因沉默系統(tǒng)（virus-induced gene silencing system, VIGS）抑制簇毛麥和T6VS-6AL中的Stpk-V，會(huì)導(dǎo)致吸器指數(shù)的增加。

 

在Bgt感染T6VS-6AL易位系小麥后，可以觀察到明顯的因超敏反應(yīng)（HypersensiMve Response，HR）引起的細(xì)胞死亡。植物的超敏反應(yīng)是植物應(yīng)對(duì)病原菌侵襲的一種保護(hù)性措施，主要表現(xiàn)是受侵細(xì)胞及其鄰近細(xì)胞的快速壞死，從而遏制病原菌的生長(zhǎng)。研究人員推測(cè)Stpk-V對(duì)Bgt的抗性可能也是通過(guò)超敏反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。

 

超敏反應(yīng)最常見(jiàn)的信號(hào)分子是H2O2，于是研究人員開(kāi)始研究三種小麥（Bgt敏感型Yangmai158，Bgt抗性型T6VS-6AL，轉(zhuǎn)化型pAHC：Stpk-V）在Bgt感染后H2O2的積累情況，并與生存情況對(duì)比。結(jié)果顯示，在Yangmai158中，H2O2僅在Bgt感染的初期大量富集，隨后含量降低，也沒(méi)有超敏反應(yīng)的發(fā)生。而在T6VS-6AL和pAHC：Stpk-V中，H2O2始終存在，從而能引起超敏反應(yīng)，遏制Bgt的進(jìn)一步侵襲。

 

綜上所述，研究小組利用表達(dá)譜芯片的方法比較Bgt感染前后的簇毛麥表達(dá)譜，篩選到了位于Pm21基因簇上發(fā)揮Bgt抗性功能的基因Stpk-V，隨后利用吸器指數(shù)實(shí)驗(yàn)和瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)證實(shí)Stpk-V確實(shí)能抑制Bgt的感染，最后通過(guò)比較三種不同基因型小麥在Bgt感染后H2O2的積累情況，發(fā)現(xiàn)Stpk-V對(duì)Bgt的抗性可能和植物的超敏反應(yīng)有關(guān)。

 

 

 

Cao A, Xing L, Wang X, Yang X, Wang W, Sun Y, Qian C, Ni J, Chen Y, Liu D, Wang X, Chen P. From the Cover: Serine/threonine kinase gene Stpk-V, a key member of powdery mildew resistance gene Pm21, confers powdery mildew resistance in wheat. Proc Natl Acad Sci USA. 2011, 108(19): 7727-7732.