高通量研究脊椎動物多維表型的新方法

Nature Communications 4, February 12, 2013, Article number:1467, doi:10.1038/ncomms2475

 

 

 

 

動物個體內(nèi)，多數(shù)由基因突變與生物活性分子所引發(fā)的復(fù)雜生理應(yīng)答機制，無法使用細胞培養(yǎng)模型進行預(yù)測，而動物水平研究卻進展緩慢。本研究中，我們利用微米分辨率的高通量光學(xué)投影層析成像系統(tǒng)，結(jié)合高效的大顆粒流式分選系統(tǒng)（Union Biometrica），實現(xiàn)了脊椎動物的整體多維度掃描。系統(tǒng)以前所未有的速度與細節(jié)，在三個維度水平，自動獲取了半透明斑馬魚幼體數(shù)以百計的獨特形態(tài)特征與復(fù)雜表型。通過聚集、量化多種表型特征，我們能夠?qū)崿F(xiàn)同時檢測、分類多個生物學(xué)進程中的精細變化。我們將這種方法稱為體內(nèi)多維表型研究。為了驗證體內(nèi)多維表型研究方法的巨大作用，我們利用200個獨立形態(tài)檢測參數(shù)，對數(shù)十種致畸劑（可引起軟骨形成異常）效應(yīng)進行分析，結(jié)合致畸劑的已知機制，識別其相似和不同之處。

 

   
針對多種因素引起的形態(tài)學(xué)變化特征，進行高通量篩選，是現(xiàn)代生物學(xué)研究與藥物篩選中必不可少的。當(dāng)前研究中，在細胞學(xué)水平高通量篩選（HTS）獲得的有效藥物，在進一步動物水平研究和臨床研究時，結(jié)果不盡如人意。即使是最復(fù)雜的體外模型，也無法完全展現(xiàn)器官形成的復(fù)雜程度與構(gòu)成等信息。為了克服體外模型在藥物篩選等應(yīng)用中的不足，越來越多的化學(xué)藥物使用斑馬魚(zebrafish、Danio rerio)個體進行篩選研究。斑馬魚幼體是目前廣泛應(yīng)用于藥物篩選的脊椎動物模型。針對斑馬魚的大規(guī)模基因水平篩選工作已經(jīng)開展了數(shù)十年，但由于所讀取的結(jié)果往往無法定量說明或局限在有限的參數(shù)記錄，因此需要更完善的解決方案。

    
為了將數(shù)百種表型的改變進行定量記錄分析，并實現(xiàn)高內(nèi)涵篩選（HCS），我們應(yīng)用高通量光學(xué)投影層析成像系統(tǒng)（high-throughput optical projection tomography system，OPT），該系統(tǒng)結(jié)合高效的大顆粒流式分選系統(tǒng)（Union Biometrica），配合特殊的圖像處理算法，能夠兼容各種顯微鏡，從而獲得微米級分辨率的3D器官或復(fù)雜形態(tài)學(xué)特征參數(shù)。這一技術(shù)幫助我們從大量動物樣本中快速獲得數(shù)百種獨特形態(tài)特征和復(fù)雜表型的信息。

 

 

1.Union Biometrica BioSorter^® Flow Cytometry（新式高通量分選OPT系統(tǒng)）：射流系統(tǒng)與顯微觀察系統(tǒng)組。BioSorte^®不需要對斑馬魚樣本進行預(yù)處理，避免了常規(guī)OPT技術(shù)中最耗費時間的步驟。

 

 

2.圖像矯正過程：通過多步圖像軟件矯正，獲得準(zhǔn)確的層析重建圖像。

 

 

3.顱面畸形三維重建與評估：每條斑馬魚幼體，記錄高達320幀的圖像，通過三維重構(gòu)技術(shù)，形象化展示了斑馬魚幼體軟骨復(fù)雜表型。圖像顯示的層析效果圖充分顯示了三種不同藥物處理后的5dpf斑馬魚幼體的顱面骨骼變化。三種藥物是：retinoic acid（視黃酸）、cyclopamine（環(huán)巴胺）和flusilazole（氟硅唑）。

 

4.藥物篩選研究實例：不同濃度環(huán)巴胺藥物對三種軟骨生長的影響

 

 

 

5.體內(nèi)多維度表型分析：為了全面定量斑馬魚幼體表型變異情況，研究者計算了202個獨立的指標(biāo)，用于重建3D表型圖。這些參數(shù)包含了長度、3D方向、表面積及各種骨骼體積等等。

 

 

 

6.大量斑馬魚幼體表型變化陣列分布：每一行代表了一種藥物作用斑馬魚幼體的影響。檢測結(jié)果以顏色表示，紅色代表幼體個體表型相對未處理幼體表達下降，綠色代表表達增長。

 

 

傳統(tǒng)藥物高內(nèi)涵篩選（HCS）技術(shù)局限在簡化的生物模型，如無線增殖的細胞系等，而在使用原代細胞、in vivo動物模型等進行HCS研究時，傳統(tǒng)技術(shù)面臨眾多的問題。本研究利用微米分辨率的高通量光學(xué)投影層析成像系統(tǒng)，結(jié)合高效的大顆粒流式分選系統(tǒng)（Union Biometrica），實現(xiàn)了脊椎動物的整體多維度掃描。本技術(shù)能夠提供脊椎動物器官和組織的3D重建圖像，針對斑馬魚幼體的研究，本技術(shù)通過能夠為研究者提供樣本個體的多種表型特征，為動物個體水平實現(xiàn)藥物高內(nèi)涵篩選（HCS）提供了可行的技術(shù)平臺。

 

 

 

Union Biometrica大顆粒流式分選系統(tǒng)：是基于流式細胞技術(shù)開發(fā)的，與普通的流式細胞技術(shù)相比有非常很重要的特點和優(yōu)勢：

這是市面上唯一的能夠分選1-1500um生物微粒的全自動高通量分選系統(tǒng)。他的管路直徑大，可以用來分選體積較大的生物微粒，因此可以用來應(yīng)用于小的模式生物，比如斑馬魚，線蟲、果蠅等，也可應(yīng)用于大體積細胞：胚胎干細胞，胰島細胞、肝細胞，細胞簇等，還可用于藥物化合物的高通量的藥物篩選。這款儀器的技術(shù)核心，是氣流分選裝置，通過氣流就行微粒的分選，這種方式非常溫和，確保了收集到的生物活體或敏感物質(zhì)的活性和完整性。

 

 

 

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