JuLI™ Stage活細(xì)胞成像儀助力ROS研究，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的動(dòng)態(tài)變化

在當(dāng)今的癌癥研究領(lǐng)域，ROS（活性氧）逐漸成為一個(gè)備受關(guān)注的熱點(diǎn)。ROS最初被視為細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物，由于其具有破壞生物分子的潛力，故曾一度被認(rèn)為是絕對(duì)有害的物質(zhì)。然而隨著研究的深入，ROS的重要性逐漸被揭示。它們?cè)谏�物體的生存與健康中扮演著至關(guān)重要的角色，尤其是在癌癥發(fā)展和治療領(lǐng)域。

癌癥細(xì)胞由于代謝活動(dòng)的旺盛，往往會(huì)產(chǎn)生較高水平的ROS。適量的ROS可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖與分化，但過(guò)高的ROS水平則可能引發(fā)細(xì)胞凋亡。這種雙重角色使得ROS在癌癥治療中具有獨(dú)特的潛力。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)影響腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞代謝的新型氧化還原信號(hào)通路、令人關(guān)注的ROS對(duì)生物分子相分離的調(diào)控，以及新型抗癌藥物開發(fā)方面取得了新的研究進(jìn)展。

ROS的活性化學(xué)性質(zhì)使其能夠快速修飾生物分子，導(dǎo)致生物分子的結(jié)構(gòu)、定位、分子間的相互作用和功能發(fā)生改變。ROS介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要發(fā)生在翻譯后水平，轉(zhuǎn)錄因子的氧化還原修飾和表觀遺傳學(xué)通過(guò)轉(zhuǎn)錄過(guò)程傳遞氧化還原信號(hào)。由于癌細(xì)胞中的ROS水平常常升高，ROS 介導(dǎo)的翻譯后修飾異常和表觀遺傳學(xué)變化可能會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因突變。這些變化還會(huì)影響腫瘤微環(huán)境（TME）中癌細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的相互作用，從而導(dǎo)致炎癥和惡病質(zhì)。

圖1 ROS 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程、與新陳代謝的相互影響以及對(duì)腫瘤微環(huán)境和免疫功能的影響

ROS對(duì)免疫系統(tǒng)的影響是多維且存在濃度依賴性的，其在本質(zhì)上可以是促進(jìn)或抑制的。全面了解ROS對(duì)免疫細(xì)胞的分級(jí)劑量效應(yīng)對(duì)于制定有效的策略以改善癌癥免疫治療至關(guān)重要。ROS的適度增加可促進(jìn)免疫細(xì)胞的多種功能，包括細(xì)胞因子等效應(yīng)物的代謝、合成和分泌。ROS還為免疫細(xì)胞，如M2巨噬細(xì)胞（Mφ）、骨髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）提供了選擇，因?yàn)樗鼈兙哂休^高的抗氧化能力，而嚴(yán)重的ROS應(yīng)激可能會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞的死亡。

圖2 ROS 對(duì)癌癥和免疫細(xì)胞功能的分級(jí)劑量效應(yīng)

在ROS應(yīng)激期間，細(xì)胞中經(jīng)常觀察到由易相分離蛋白形成的無(wú)膜細(xì)胞器，在這些細(xì)胞中，具有特定功能的蛋白質(zhì)/酶和底物同時(shí)集中，以高效地促進(jìn)某些生化過(guò)程。ROS可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)相分離：①通過(guò)ROS介導(dǎo)的PTM發(fā)生相分離；②p62/Sequestosome-1 (SQSTM1) 與泛素化蛋白結(jié)合并發(fā)生相分離；③ROS誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒（SG）形成，以防止翻譯從而減少氧化應(yīng)激下錯(cuò)誤折疊蛋白的積累；④脂滴可從細(xì)胞膜中吸收多不飽和脂肪酸，防止細(xì)胞膜過(guò)氧化；⑤癌細(xì)胞可能通過(guò)形成 G 體來(lái)提高糖酵解效率。

圖3 ROS在相分離中的作用

圖4 ROS在誘導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡中的作用

氧化還原穩(wěn)態(tài)對(duì)于癌細(xì)胞、癌癥干細(xì)胞、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中的其他細(xì)胞的生存至關(guān)重要。破壞ROS產(chǎn)生和消除之間的平衡將對(duì)癌細(xì)胞的存活和藥物敏感性產(chǎn)生重大影響。氧化還原調(diào)節(jié)的治療策略包括①靶向抑制或激活ROS的生成和②抑制或重新激活氧化還原適應(yīng)。除了針對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，還有其他針對(duì)ROS的治療策略，如光動(dòng)力療法和光熱療法可誘導(dǎo)ER應(yīng)激、ROS生成和癌細(xì)胞死亡。

ROS作為細(xì)胞代謝過(guò)程中的重要產(chǎn)物，具有雙重功能。適量的ROS在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要作用，而過(guò)量的ROS則會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進(jìn)而引發(fā)多種疾病。以癌癥中的 ROS 為靶點(diǎn)是一種前景廣闊的治療策略，同時(shí)也帶來(lái)了新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。JuLI™ Stage活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)在活性氧應(yīng)用中發(fā)揮重要作用，它能夠動(dòng)態(tài)觀察和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的變化過(guò)程，使得研究人員能夠在更接近生理?xiàng)l件的環(huán)境下觀察細(xì)胞行為，從而獲得更準(zhǔn)確、更全面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

蘇州奎克泰生物的JuLI™ Stage活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)，是一款能夠長(zhǎng)時(shí)間放在培養(yǎng)箱內(nèi)，無(wú)需反復(fù)取出即可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和分析細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程的成像設(shè)備。JuLI™ Stage活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)配備明場(chǎng)和三色熒光（GFP、RFP、DAPI），具有全自動(dòng)X-Y-Z軸、自動(dòng)聚焦和手動(dòng)聚焦、圖像拼接等功能，配備各種分析軟件，能夠批量計(jì)算細(xì)胞數(shù)量、大小、面積、熒光強(qiáng)度等。

仁荷大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)系研究人員于2020年在《International Journal of Molecular Sciences》期刊發(fā)表名為“Adenosine Triphosphate Accumulated Following Cerebral Ischemia Induces Neutrophil Extracellular Trap Formation”的文章。在這篇文章中，研究者探討了腦缺血后釋放的細(xì)胞外 ATP 是否會(huì)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的炎性細(xì)胞死亡方式（NETosis），以及其潛在的分子機(jī)制和信號(hào)通路是什么。
 

文章中檢測(cè)Ca²⁺水平，使用 Fluo-4-AM 測(cè)量血液中性粒細(xì)胞內(nèi) Ca²⁺水平。將細(xì)胞與4 µM的Fluo-4-AM 共孵育15 分鐘，用 HBSS洗滌后進(jìn)行細(xì)胞接種，使用JuLI™ Stage監(jiān)測(cè)Fluo-4-AM熒光強(qiáng)度變化，后與ImageJ聯(lián)用對(duì)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)BzATP 處理過(guò)的血液中性粒細(xì)胞內(nèi)的Ca²⁺水平顯著升高，而使用 A438079（10 µM）或BAPTA-AM （10 µM）預(yù)處理細(xì)胞后，Ca²⁺水平明顯降低。

研究者還將血液嗜中性粒細(xì)胞或bm-嗜中性粒細(xì)胞在含有1µM 的CM-H2DCFDA（一種通用的ROS指示劑）中孵育30 min。用PBS洗滌細(xì)胞兩次，使用JuLI™ Stage活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)觀察熒光圖像。獲得圖像結(jié)果后與ImageJ聯(lián)用對(duì)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明使用CM-H2DCFDA檢測(cè)ROS的產(chǎn)生時(shí)，發(fā)現(xiàn)ATP處理細(xì)胞2h后血液中性粒細(xì)胞的CM-H2DCFDA熒光強(qiáng)度顯著增加， 但在 A438079（10 μM）、BAPTA-AM（10 μM）或 Gö6983 （10 μM）預(yù)處理細(xì)胞20min 發(fā)現(xiàn)CM-H2DCFDA 的熒光強(qiáng)度被明顯抑制，表明ATP以P2X7R-、Ca²⁺-和PKC依賴的方式誘導(dǎo)血液中性粒細(xì)胞產(chǎn)生ROS。
 

JuLI™ Stage活細(xì)胞成像儀助力ROS研究，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的動(dòng)態(tài)變化，省時(shí)、省力，幫助科研工作者實(shí)驗(yàn)更高效！

[1]Glorieux C, Liu S, Trachootham D, Huang P. Targeting ROS in cancer: rationale and strategies. Nat Rev Drug Discov. 2024 Aug;23(8):583-606.

[2]Kim SW, Davaanyam D, Seol SI, Lee HK, Lee H, Lee JK. Adenosine Triphosphate Accumulated Following Cerebral Ischemia Induces Neutrophil Extracellular Trap Formation. Int J Mol Sci. 2020 Oct 16;21(20):7668.