血清中 miRNA 抽提和實驗設計經(jīng)驗談

人體內(nèi)的血液循環(huán)系統(tǒng)猶如印度的圣河 – 恒河，河水中攜帶的養(yǎng)分滋養(yǎng)著古老的大地；洗滌帶走地上的ㄧ切污穢，人們的一生都在河水中完成。如此的恒河可以想象，河水中充斥著各種物質(zhì)，有廢物有養(yǎng)分，只要你想都可以從河水中撈取。同樣的我們的循環(huán)系統(tǒng)如同恒河；流動的血液如同恒河水，身體所需的ㄧ切由血液運送，身體產(chǎn)生的廢物也由血液清運，同樣可以想象血中的成份也是包羅萬象。如果我們想知道大地有多純凈或污染有多嚴重，只要取一瓢水加以檢視就可以知道答案；而相同的想了解人的生理狀況，取一滴血加以檢驗也可以知道端倪，但是做這些檢測并非漫無目標的，必須要知道哪ㄧ些物質(zhì)是所謂的指針，在生物體內(nèi)的這些指針就是我們熟知的生物標記(biomarker)。生物標記的研究和應用已有ㄧ段光景，各項代謝疾病的篩檢廣泛的被使用，而在癌癥的篩檢也已經(jīng)有ㄧ些不錯的生物標記，例如 AFP (Alpha-fetoprotein)。順著 microRNA (miRNA) 的發(fā)現(xiàn)和研究熱潮，已經(jīng)約有 1000 個 miRNA 被發(fā)掘表現(xiàn)于人體中，miRNA 調(diào)控人體內(nèi)基因表現(xiàn)的生理功能也為人們所熟知，加上 miRNA 相對于蛋白質(zhì)標志的高穩(wěn)定性，伴隨著檢測技術的一日千里，讓血液中的 miRNA 表現(xiàn)成為新一代尋找生物標記的標的。本文內(nèi)容介紹主要是以實驗室在操作血清 miRNA 的萃取和芯片實驗所累積的經(jīng)驗，和讀者分享實驗上遇到的ㄧ些難題和解決的方法。
 
血液中 miRNA 的組成
        血液中的 miRNA 到底是從何而來? 要往哪里去? 這些 miRNA 的生理功能是什么?以上這三個問題是很多研究人員關心的問題，事實上這些問題目前并沒有很明確的答案，我們知道 miRNA 是內(nèi)生性的短片段 RNA，長度約 17 到 23 核苷酸，miRNA 可以藉由和信息 RNA (mRNA) 結合誘導信息 RNA 的降解，進而調(diào)控信息 RNA 和相對蛋白的表現(xiàn)。根據(jù)一些論文的揭示1和實驗室實際的操作經(jīng)驗顯示，正常人的血液中 miRNA 的含量是極微量的，但是在病人和檢體制備不佳的血液樣本中卻可抽取到較大量的 miRNA，根據(jù)這些觀察現(xiàn)象的合理臆測，病人血清中 miRNA 的來源，很有可能是因疾病造成的組織壞死或細胞凋亡破裂而流泄出來的胞內(nèi) miRNA，經(jīng)由病人和正常人的基因表現(xiàn)的芯片圖譜比較，結果也傾向有或無表現(xiàn)的差異，而非特定 miRNA 表現(xiàn)量上升；換言之，我們觀察到相關的研究中，病人的 miRNA的表現(xiàn)數(shù)目增加了，而分析ㄧ些在正常人和病人中都有表現(xiàn)的 miRNA，表現(xiàn)量的高、低反而是其次的表征。因此數(shù)據(jù)分析的邏輯和方法也必須根據(jù)之而調(diào)整，但這些呈現(xiàn)異位性表現(xiàn)(ectopic expression)的 miRNA 并不影響其成為診斷疾病和預后評估的標志的可能性。已經(jīng)有一些研究指出，這些不經(jīng)常表現(xiàn)在循環(huán)系統(tǒng)的 miRNA 可以成為良好的疾病診斷標志，如 miR-141 可以作為前列腺癌的指標，miR-499 及 miR-208 和心肌梗塞(myocardial infraction)相關，miR-122 和藥物造成的肝臟損傷有關。
 
血清中 miRNA 抽提的挑戰(zhàn)
1、檢體的備制：血清(serum)好還是血漿(plasma)好?
    臨床上會根據(jù)檢驗的標的來選擇血液檢體的保存及制備方式，血清和血漿都是來自血液檢體的成分，但是根據(jù)制備的方式導致本質(zhì)上含有成分有所不同�；�于制備的方法可知，血清是血液經(jīng)由凝血反應后，再經(jīng)由離心沈淀所得到的上清液。而血漿則是血液在不凝血的狀況下，經(jīng)由離心去除血球后的液體。然而有文獻指出，針對同一個人的血清和血漿樣本抽提出來的 miRNA 的總量作比較，很明顯的血清抽提的總量明顯比血漿抽提的來得高，這意謂著制備的方法也會影響miRNA 的抽提，據(jù)推測這些 miRNA 可能是因為凝血反應，血小板或紅血球破裂后釋出的物質(zhì)，其中包含 miRNA，雖然大部分的實時定量聚合鏈反應(q-PCR)驗證結果顯示，血漿和血液的 miRNA 的表現(xiàn)圖譜并無顯著差異，然而這個已經(jīng)存在的風險，可能在研究設計也是需要被考慮，因此就理論上來說，是以血漿的檢體較適合作為生物標記的找尋。
 
2、檢體的備制或保存不良是否可用?
    已知血清或血漿中的 miRNA 的來源可能來自胞內(nèi)和胞外，尤其是血球(紅血球或白血球等)，因此處理方式不當會造成檢體的污染，改變 miRNA 的組成和表現(xiàn)量，造成研究結果的偏差，尤其紅血球的溶血現(xiàn)象影響甚劇，不僅會造成紅血球 miRNA 污染而且紅血球中的大片段 mRNA 亦會造成定量的失準和因降解而形成實驗的偽陽性產(chǎn)生。因此備制檢體時也要避免造成血球破裂的動作，如用太細的針頭抽血、或檢體保存不當造成溶血、或病人本身因疾病或治療造成的敗血或溶血現(xiàn)象可能也是必須列入評估的考慮因素。此外抗凝血劑的使用必須避免使用含有肝素 heparin 的凝血管，已知 heparin 會抑制反轉錄 (reverse transcription) 和聚合酶 (polymerase) 的反應，如果檢體會進行 q-PCR 的驗證一定要避免。同樣的血液檢體也含有抑制反轉錄和聚合酶的成分，如果萃取時沒有移除干凈則會造成后續(xù)實驗的失敗產(chǎn)生。
 
miRNA 的抽提方法
    基本上血液中的 miRNA 也是 RNA，只是片段較短，因此萃取的方式和原理和其他 RNA 的萃取方式大同小異，目前市面上也有許多的萃取套組可供選擇，萃取的方式以有機溶劑如：Trizol LS，或通管柱(column)的方式進行，均可以有不錯的回收率，抽提方式可以參考今年 4 月份華聯(lián)快訊 – RNA 抽提。只有一點要特別提醒讀者的，使用有機溶劑方式萃取(phenol-chloroform)容易會有鹽類和有機溶劑殘留，會影響定量和抑制后續(xù)實驗操作反應，因此操作上必須避免抽取到有機溶劑，可增加酒精清洗步驟一到兩次，洗去殘留鹽類。當然使用管柱抽提可以輕易避免這些潛在問題的風險。
 
miRNA 的定量
      在抽提成功的情形下，血清和血漿中僅含有少量的 RNA，1 mL 血的抽提總量可能都在 ng 甚或 pg 等級，這樣的結果意謂著，運用現(xiàn)行的分亮度計來測 OD 是不可行的(以 NaroDrop 為例：待測濃度需高達10ng/uL才可信)，而Agilent bioanalyzer 2100 也僅能做到定性的檢測，沒法做精準的定量。檢視現(xiàn)行被使用的定量方法大概有：(一)在等體積的血清或血液樣本中加入外控核酸(spike)，經(jīng)由抽提步驟后可經(jīng)由偵測外加的 spike 來校正抽提的總量及效率，作為校正檢體因抽提效率或誤差造成的差異。然而這只適用在檢體備制完美及控制抽取技術無誤，對于個體表現(xiàn)差異大和檢體備制質(zhì)量不一的檢體，并沒有辦法達到管控的效用；(二)經(jīng)過分亮度計測 OD 加以定量，但是除非抽提出的量達到分亮度計的可信水平，否則這些數(shù)值大概都是假訊號，并不足以采信；(三) 使用內(nèi)控基因的表現(xiàn)量來做為校正。但根據(jù)研究指出其實血清或血漿中 miRNA 的表現(xiàn)數(shù)量是有很大的個體差異的，以正常人當研究對象分析其表現(xiàn)的 miRNA 數(shù)量，最低 123 個；最高有 296 個1，可以有高達兩倍的差距，再加上沒有適合的內(nèi)控基因 (internal control gene) 可以做為控制組，公認常用的內(nèi)控基因 U6 或 SNORD  RNAs 等，在個體間的表現(xiàn)也是差異很大并不適用。因此透過 Agilent Bioanalyzer 2100 的結果進行 miRNA相對定量；或從等體積血清抽提出 miRNA 再等比例取出進行實驗，似乎是較可信的做法，但是還是要取決于實驗的設計來決定。
 
結語       
       當我們理解了實驗的設計和預期可能的結果，避開了可能的干擾因素，做完芯片實驗拿到結果后，可能要先審視一下原始數(shù)據(jù)再決定要用那種方法來分析數(shù)據(jù)，例如；假設控制組只有表現(xiàn) 200 個 miRNA，但是病人組表現(xiàn) 400 個，那經(jīng)常被使用的芯片校正方法如：median scaling 或75th percentile，可能就不適用。至于哪一種分析方式是較理想? 可能沒有標準答案，必須根據(jù)實驗設計和檢視數(shù)據(jù)來擬訂，這個說來話長，又是另一個故事了，如果有興趣的讀者可以洽詢我們的生物信息分析專業(yè)團隊。以上是實驗室從事血清中 miRNA 的芯片實驗研究，所累積的一點小小心得，希望對正在進行或準備進行這類研究的讀者有所幫助。
 
參考資料
(1) Wang K., et al., Comparing the MicroRNA Spectrum between Serum and Plasma. PLoS One. 2012
(2)_Huang Z., et al., Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer. Int J Cancer. 2010 Jul 1;127(1):118-26.