高內(nèi)涵成像技術(shù)在網(wǎng)絡(luò)集成式細(xì)胞內(nèi)特征的公共數(shù)據(jù)庫（LINCS）項目中的應(yīng)用-Molecular Devices ImageXpress MicroXLS

 

應(yīng)用ImageXpress® Micro高內(nèi)涵成像系統(tǒng)可快速、方便、高通量的測量細(xì)胞對小分子藥物的多參數(shù)生理變化，并且使用三種熒光染料對活細(xì)胞進(jìn)行染色，只需一步，無需清洗，對于貼壁性不好的有絲分裂細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，這種方法比傳統(tǒng)的基于免疫熒光染色的方法更加準(zhǔn)確。應(yīng)用此法得到的數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳到NIH的LINCS公共數(shù)據(jù)庫中()。

 

在傳統(tǒng)免疫熒光法和一步熒光染料法的對比實驗中，免疫熒光法用phospho(Ser10) Histone H3標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞，antcleaved PARP1標(biāo)記凋亡細(xì)胞。染料法用LysoTracker-Red顯示細(xì)胞形態(tài)，DEVDNucView488 caspase-3標(biāo)記凋亡細(xì)胞。兩種方法均用Hoechst 33342標(biāo)記細(xì)胞核。免疫熒光法是將細(xì)胞固定后進(jìn)行抗體染色步驟，包括沖洗板子，而熒光染料法是染色后再固定細(xì)胞，并且在采集圖像前沒有沖洗的步驟。

 

實驗中用典型的抗有絲分裂藥物紫杉醇處理人膀胱癌5637細(xì)胞（圖4）。在無藥物的對照組，這兩種實驗方法的結(jié)果十分相近，包括細(xì)胞密度、細(xì)胞核形態(tài)、%有絲分裂、%凋亡細(xì)胞。在紫杉醇處理24小時后，兩種實驗方法中的有絲分裂細(xì)胞數(shù)均顯示出明顯增加。但是，凋亡細(xì)胞數(shù)在免疫熒光法中明顯少于熒光染料法。這說明免疫熒光法沖洗板子的過程雖然可以有效的保留有絲分裂細(xì)胞，但會使凋亡細(xì)胞損失。為了證明這一結(jié)論，我們用紫杉醇處理細(xì)胞48小時后，用熒光染料法染色，先按正常程序不沖洗，采集下圖像后，再用PBS沖洗三次模擬免疫熒光法，采集同樣位置的圖像，沖洗前后的圖像對比如圖4C所示。沖洗后，NucView488陽性細(xì)胞大量減少，另外，洗前的圖像中有很多圓形、脹大、模糊的被LysoTracker-Red和NucView488染色很弱的核，而在沖洗后這些核完全丟失了。從細(xì)胞形態(tài)及染色情況看，這些應(yīng)屬于晚期凋亡細(xì)胞。

 

接下來我們評估了熒光染色高內(nèi)涵法的自動表型算法（圖5）。5637細(xì)胞分別經(jīng)過DMSO、200nM紫杉醇處理24小時、200nM紫杉醇處理48小時。不同表型的細(xì)胞被不同顏色輪廓標(biāo)記出來：分裂間期細(xì)胞為白色，有絲分裂細(xì)胞為紅色，早期凋亡細(xì)胞為綠色，晚期凋亡細(xì)胞為黃色。為了評估自動分析的準(zhǔn)確性，我們從每種處理中隨意挑選了12張圖片進(jìn)行手動計數(shù)，作為標(biāo)準(zhǔn)與自動分析結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示兩種計算方法非常相近，雖然自動分析中間期細(xì)胞數(shù)量略高，有絲分裂和凋亡細(xì)胞數(shù)量略低，但是誤差很小，并不影響藥物評價。

 

圖4 人類膀胱癌5637細(xì)胞基于抗體和基于染料的實驗對比。（A）基于抗體和基于染料的實驗中單一通道和疊加圖像的對比，DMSO對照（左）和200nM紫杉醇（右）處理24小時。（B）柱狀圖顯示了兩種實驗方法在DMSO和200nM紫杉醇處理24小時處理后的對比，對比參數(shù)包括總細(xì)胞數(shù)、有絲分裂細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)。所有的細(xì)胞計數(shù)都是每孔統(tǒng)計了超過4個視野，并取超過48個重復(fù)孔的平均值得到的。（C）細(xì)胞被200nM紫杉醇處理48小時后用染料染色，對比實驗孔板在沖洗前后同一位置單一通道和疊加圖像。

 

               

圖5 染色實驗方法的圖像自定義分析分割結(jié)果。5637細(xì)胞在DMSO、200nM紫杉醇處理24小時和200nM紫杉醇處理48小時后的原始圖像（上）和Hoechst分析圖像（下）。分裂間期細(xì)胞為白色，有絲分裂細(xì)胞為紅色，早期凋亡細(xì)胞為綠色，晚期凋亡細(xì)胞為黃色。（B）自動分析（藍(lán)色）和手工計數(shù)（紅色）的比較，依次為總細(xì)胞數(shù)、有絲分裂細(xì)胞數(shù)、凋亡細(xì)胞數(shù)和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)。所有的細(xì)胞數(shù)均為超過12個圖像的平均值。