活細(xì)胞熒光成像的新型標(biāo)記法及其在STED中的應(yīng)用-下

作者：張坤博士 徠卡顯微系統(tǒng) 生命科學(xué)部 應(yīng)用專員

如何免除活細(xì)胞標(biāo)記中的清洗（washout）步驟？

SNAP-tag等標(biāo)記方法為活細(xì)胞顯微成像帶來了革命性的變化，也因此被Nature雜志評為2004年最熱門的科研技術(shù)之一。但是傳統(tǒng)的SNAP-tag標(biāo)記仍然有很大的缺陷。將帶有熒光探針的底物BG加入細(xì)胞后需要多次清洗細(xì)胞，才能將未結(jié)合的BG去除從而消除背景熒光對成像的影響。即不能實時在底物與SNAP-tag結(jié)合的過程中，跟蹤SNAP-tag融合蛋白的動態(tài)變化。YasuteruU等科學(xué)家基于SNAP-tag研發(fā)了一種熒光偶聯(lián)性激活標(biāo)記方法（fluorescenceactivation-coupled protein labeling, FAPL），通過改造SNAP-tag的底物來解決這一問題，從而能夠?qū)崟r的記錄細(xì)胞內(nèi)一些動態(tài)的生命過程，如蛋白表達(dá)、定位、轉(zhuǎn)運及降解等過程[13-15]。在Snap-tag底物BG鳥嘌呤的C-8位置引入一個淬滅基團(tuán)，可以有效的通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)或光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（Photoinduced electron transfer，PET）吸收BG上標(biāo)記的熒光基團(tuán)熒光能量，使其在與SNAP-tag結(jié)合之前是不會發(fā)出熒光的。一旦底物與SNAP-tag結(jié)合，該淬滅基團(tuán)就會解離下來，熒光基團(tuán)將發(fā)出熒光（圖4）。因此熒光信號只有在SNAP-tag融合蛋白上才會被點燃，所以也就不再需要任何的清洗步驟。Utrano及其同事已經(jīng)成功的將這種標(biāo)記方法應(yīng)用于研究細(xì)胞運動中表皮生長因子受體（EGFR）相關(guān)的膜運輸過程（圖5）[13]。

圖3.HEK293活細(xì)胞中ATTO647N和Chromeo494分別標(biāo)記的EGF和EGFR的STED超高分辨率成像。由圖E、F、K、L可以看出，STED對EGFR-EGR復(fù)合體的成像分辨率比共聚焦提高了3~4倍。

圖4. 傳統(tǒng)的SNAP-tag標(biāo)記方法與基于FAPL的SNAP-tag標(biāo)記方法比較

圖5.EGFR在細(xì)胞中轉(zhuǎn)運的實時記錄。（a）示意圖，用于解釋如何利用FAPL探針來實時追蹤EGFR相關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運過程。（b）COS7細(xì)胞中表達(dá)的EGFR用DRBG-488標(biāo)記（綠色），溶酶體用lysosometracker（紅色）標(biāo)記。（c）對表達(dá)SNAP-EGFR–CFP的MDCK細(xì)胞進(jìn)行共聚焦實時成像。SNAP-EGFR-CFP用DRBG-488進(jìn)行標(biāo)記。在5min時加入了EGF刺激細(xì)胞，每個1min拍攝一次熒光圖像。相對于CFP的成像，DRBG-488能夠更清楚的記錄EGF刺激之后囊泡的形成及其在溶酶體里的聚集。

為了能夠消除自發(fā)熒光，更清楚的對更深的組織甚至是活體動物進(jìn)行熒光成像，科學(xué)家們對近紅外染料的研發(fā)從未止步過[16]。Johnsson等科學(xué)家最近基于sillion-rhodamine熒光基團(tuán)，推出了一款新的細(xì)胞膜通透性的近紅外染料（SiR）[17]。在未與SNAP-tag等標(biāo)簽結(jié)合之前，成聚集狀或者與疏水結(jié)構(gòu)非特異性結(jié)合的SiR會處于不發(fā)熒光的螺甾內(nèi)酯狀態(tài)；一旦與標(biāo)簽蛋白結(jié)合，SiR將處于兩性離子狀態(tài)，而發(fā)出很強(qiáng)的熒光（圖6）。將SNAP-tag的底物標(biāo)記SiR便形成了SiR-SNAP。因此，利用SiR-SNAP對活細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記時，背景熒光非常低，從而免除了清洗步驟，實現(xiàn)實時的熒光探測。同時由于其光譜的近紅外特性，可以應(yīng)用于深層組織，如大腦切片的成像（圖7）。

圖6. （A）SiR的兩種形式。（B）SiR的激發(fā)光譜（藍(lán)色虛線）和發(fā)射光譜（紅色實線）。

圖7. SiR-SNAP標(biāo)記的大鼠腦片。a,子宮內(nèi)原位電轉(zhuǎn)示意圖。紅色方框內(nèi)的區(qū)域即為b圖中進(jìn)行熒光成像的區(qū)域。b,通過子宮內(nèi)原位電轉(zhuǎn)將SNAP和GFP的質(zhì)粒以1:1的比例導(dǎo)入到E16期的神經(jīng)元前體細(xì)胞中。對E19期的大鼠腦組織進(jìn)行了切片并用SiR-SNAP和Hoechst進(jìn)行了染色。c,對b圖中黃色方框區(qū)域的放大，GFP和SiR-SNAP的良好共定位驗證了SiR-SNAP標(biāo)記的特異性。

SiR在STED超高分辨率顯微成像中的應(yīng)用

Johnsson及其同事也將SiR-SNAP應(yīng)用到STED超高分辨率顯微鏡對中心體蛋白Cep41的活細(xì)胞成像中[17]（圖8）。共聚焦圖像顯示SiR-SNAP標(biāo)記的U2OS細(xì)胞中的Cep41-SNAP在微管及中心體中均有定位（圖8b）。STED超高分辨率顯微鏡發(fā)現(xiàn)SNAP-Cep41以環(huán)形排列在中心體上，該環(huán)形的直徑為175±13nm （n=7），這說明Cep41定位于微管形成的中心粒壁上（圖8d）。Z軸方向成像顯示由SNAP-Cep41形成的結(jié)構(gòu)大約長440±28nm （n=16），這與已經(jīng)報道的中心粒的長度是一致的，這說明Cep41形成的環(huán)形結(jié)構(gòu)貫穿于整個中心粒。

圖8. U2OS活細(xì)胞中Cep41的共聚焦及STED成像。a, 中心體結(jié)構(gòu)示意圖。b,SiR-SNAP標(biāo)記的Cep41和Hoechest 33342標(biāo)記的細(xì)胞核的雙色共聚焦圖像。c,結(jié)合于微管的Cep41的共聚焦及STED熒光圖像。d,位于中心體的Cep41的共聚焦及STED熒光圖像。標(biāo)尺，500nm。

細(xì)胞骨架如微管、微絲等一直是生命科學(xué)研究的重點。近期Johnsson等科學(xué)家將SiR直接標(biāo)記于與微管和微絲分別特異性結(jié)合的小分子docetaxel和jasplakinolide，即形成SiR-tubulin和SiR-actin，實現(xiàn)了在不對細(xì)胞或組織進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染或基因組修飾的條件下直接進(jìn)行活細(xì)胞成像[18]（圖9）。SiR-tubulin和SiR-actin仍然保留了SiR的優(yōu)良特性，非常適用于STED成像（圖10）。SiR-tubulin標(biāo)記人成纖維活細(xì)胞中的微管后, STED超高分辨率顯微鏡揭示了細(xì)胞質(zhì)中及中心體上tubulin的定位及結(jié)構(gòu)信息。在這種標(biāo)記和成像方法下，細(xì)胞質(zhì)中微管的粗細(xì)測量為39±10 nm, 這是目前活細(xì)胞中微管成像的最高分辨率。STED成像也清晰的揭示了中心體上的微管以9個亞復(fù)合體排布成直徑約176±10 nm的環(huán)形（圖10a，b），兩個臨近亞復(fù)合體之間的夾角成39°±13°（圖10c），這些數(shù)據(jù)與之前用電子顯微鏡研究得到的數(shù)據(jù)是一致的[19]。SiR-actin標(biāo)記活的大鼠海馬區(qū)原代神經(jīng)元后，STED超高分辨率顯微鏡揭示了微絲在軸突上以181±20 nm的區(qū)間成周期性排布（圖10d-f），這與之前用固定的樣品得到的結(jié)果是一致的[20]。這些數(shù)據(jù)充分說明了SiR-actin和SiR-tubulin在活細(xì)胞超高分辨率顯微鏡成像中使用的便捷性及可靠性。目前SiR-tubulin和SiR-actin已經(jīng)被Spipochrome公司商品化，使用方法也有非常詳細(xì)的描述。

圖9. SiR-tubulin和SiR-actin。a, SiR-tubulin和SiR-actin的分子結(jié)構(gòu)。b，SiR-tubulin和SiR-actin只有在分別結(jié)合了微管或微絲后才能發(fā)出熒光。c，SiR-tubulin和SiR-actin標(biāo)記的人成纖維細(xì)胞，結(jié)構(gòu)照明成像，標(biāo)尺，5 mm。

圖10. SiR-tubulin和SiR-actin標(biāo)記的活細(xì)胞的STED成像。（a）人成纖維活細(xì)胞中心體上微管的STED代表性圖像(已經(jīng)過Richardson-lucy反卷積運算)。（b）人和小鼠的中心粒的直徑。（c）人和小鼠中心粒中臨近的兩個微管亞復(fù)合體之間夾角。（d）16天的大鼠海馬區(qū)元代神經(jīng)元在用SiR-actin染色后的STED原始圖像。（e-f）微絲在神經(jīng)元軸突上以間隔為181±20 nm的距離成周期性分布。

總結(jié)

新的熒光探針和成像技術(shù)的發(fā)展，極大地加快了生命科學(xué)探索的步伐，并將繼續(xù)為細(xì)胞生命活動提供極其重要的新見解。近十年中，超高分辨率和單分子顯微鏡發(fā)展迅速并越來越成熟化，可以預(yù)見在不就的將來利用超高分辨率顯微鏡對活細(xì)胞進(jìn)行成像將成為非常常規(guī)的科研手段。作為在這個方向邁出的一步，各種各樣的新型活細(xì)胞標(biāo)記方法和熒光探針的研發(fā)也得到了越來越多的科學(xué)家的青睞和重視�？傮w來說，SNAP-tag等標(biāo)簽標(biāo)記方法已經(jīng)在活細(xì)胞系統(tǒng)的研究和操控中顯示出極大的潛力。而SiR等新型染料的研發(fā)必將進(jìn)一步推進(jìn)超高分辨率顯微鏡在活細(xì)胞成像中的應(yīng)用。

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