如何使用SpectraMax® M5 多功能微孔板讀板機和IMAP® 熒光偏振檢測平臺進行激酶活性的分析

 

 

蛋白激酶在調(diào)節(jié)許多細胞反應(yīng)過程時起著核心的作用。近年來已經(jīng)成為癌癥和其它許多疾病藥物重要的作用靶點。IMA P是Molecular Devices 公司推出一種快速、非放射性的激酶檢測技術(shù)，由于技術(shù)本身特點其非常適合用于進行試驗優(yōu)化和高通量的篩選。 IMAP檢測技術(shù)基于的原理是磷酸根離子與表面固化有三價金屬離子的納米球顆粒的一種結(jié)合作用。當(dāng)這種結(jié)合反應(yīng)發(fā)生后，熒光標(biāo)記的多肽分子的運動軌跡發(fā)生了改變，熒光標(biāo)記復(fù)合物的熒光偏振值就會增加(See Figure 1.)。因為是一種均相的，可忽視底物多肽序列的一種檢測方法，所以可廣泛的應(yīng)用于多種激酶的檢測。

 

當(dāng)使用 IMAP技術(shù)進行試驗優(yōu)化和高通量的篩選時，SpectraMax M5多功能微孔板讀板機可作為其非常理想的、可靠的檢測平臺。SpectraMax M5是一種基于光柵型單色器的多功能微孔板讀板機，允許使用者針對不同的熒光染料分子隨意選擇不同的檢測波長，而無需額外再選購濾光片配件。這篇應(yīng)用文章詳細的描述了在進行IMAP熒光偏振激酶試驗時，如何使用SpectraMax M5多功能微孔板讀板機和 SoftMax® Pro 軟件進行檢測和分別對紅色及綠色熒光底物來校正曲線。LCK是一種酪氨酸酶，在T細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮著非常關(guān)鍵作用，制備其稀釋曲線。另外Akt1/PKBa，一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，參與磷脂酰肌醇激酶3的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞活力。通過十字孢堿抑制A k t 1 / P K B a 的試驗中， 計算FAM 和TAMRA分別標(biāo)記的多肽底物在反應(yīng)過程始中獲得的Z'因子值，其結(jié)果與濾光片式多功能微孔板讀板機上獲得的結(jié)果相一致。

 

IMAP快速篩選試劑盒( Molec ular  Devices Cat. #R8125)

IMAP結(jié)合試劑

IMAP 結(jié)合緩沖液 A (5X)

IMAP結(jié)合緩沖液B (5X)

IMAP反應(yīng)緩沖液（5X）

LCK激酶(Upstate Cat. #14-442)

標(biāo)記FAM - p34cdc 2 多肽底物(Molecular Devices Cat. #R7157)

標(biāo)記TAMRA - p34cdc 2多肽底物(Molecular Devices Cat. #R7309)

標(biāo)記FAM-p34cdc2來源的磷酸化多肽校正試劑(Molecular Devices Cat.#R7271)

貯存在純水中的50 mM Adenosine 5’triphosphate (ATP)(Sigma Cat. #A6559)

貯存在純水中的100 mM DL-Dithiothreitol(DTT)(Sigma Cat. #D9779)

十字孢堿 (Staurosporine) Biomol Cat.#EI-156)

黑色聚苯乙烯材質(zhì)的384孔板(Corning Cat. #3710)

預(yù)裝有SoftMax Pro軟件電腦及連接SpectraMax M5 多功能微孔板讀板機(Molecular Devices)

 

步驟1.在1xIMAP反應(yīng)緩沖液中加入DTT，并使DTT得終濃度達到1mM(1:100稀釋100mM的DTT貯存液)，得到完整的反應(yīng)緩沖液(CRB)；

步驟2.在CRB中制備400nM(4x)的FAM或TAMRA標(biāo)記的多肽底物(1:50稀釋原20uM的多肽貯存液)；

步驟3.在CRB中制備20uM(4x)的ATP( 1 : 2 5 0 0稀釋原50mM的ATP貯存液)；

步驟4.準備一份終濃度為4x的酶梯度稀釋液。對于激酶抑制劑試驗，使用恒定濃度的酶，并制備出一組十字孢堿或其它激酶抑制劑的梯度稀釋液。

步驟5.

將下列試劑平行的加入4個復(fù)孔的激酶反應(yīng)體系中：

5ul CRB或十字孢堿

5ul酶(對于沒有添加酶的背景孔，加入5ul CRB作為替代)

5ul 20uM的ATP貯存液

5ul 400 nM的多肽貯存液

步驟6.室溫孵育1到1.5小時。

 

步驟1.在CRB中制備一份100nM的多肽貯存液(使用與激酶試驗中相同的底物)；

步驟2. 在CRB中制備一份100nM的磷酸多肽貯存液(使用與激酶試驗中相同的磷酸化底物)；

步驟3.如圖表1所示將多肽和磷酸化多肽貯存液按照一定規(guī)律混合后，制備校正標(biāo)準品。樣品量足夠4個復(fù)孔所需；

步驟4.各移出20ul校正標(biāo)準品到4個復(fù)孔中，包括一組只有20ul CRB的空白背景樣本。

 

 

 

步驟1.將75%的結(jié)合緩沖液A與25%的結(jié)合緩沖液B混合，制備結(jié)合緩沖液；

步驟2.將結(jié)合試劑以1:600倍稀釋成結(jié)合緩沖液，得到結(jié)合反應(yīng)液；

步驟3.移出60ul結(jié)合反應(yīng)液到每個檢測孔和校正標(biāo)準孔中(包括背景孔樣本)

步驟4.室溫避光孵育1小時

 

在SoftMax Pro軟件上設(shè)置模板，并在SpectraMax M5多功能微孔板讀板機上進行讀數(shù)

Note：FAM和TAMRA標(biāo)記底物的IMAP熒光偏正實驗的模板在SoftMax Pro 5 軟件上已預(yù)設(shè)好，詳見Binding Assays模板文件夾。

 

步驟1.打開SoftMax Pro軟件上針對熒光素使用的IMAP 熒光偏振模板。FAM和TAMRA模板已預(yù)設(shè)好；如果使用的不是FAM和TAMRA熒光素，只需調(diào)整波長設(shè)置即可。對于SpectraMax M5多功能微孔板讀板機上的參數(shù)設(shè)置（見圖表2）。

 

 

步驟2.設(shè)置一個試驗?zāi)０澹�選定背景樣品本孔、激酶樣品本孔、校正標(biāo)準品孔。激酶試驗樣品和校正標(biāo)準品可分到SoftMax Pro軟件模板上預(yù)設(shè)好的8個樣本組中。在計算最小偏振值（mP）之前，首先將只含有緩沖液的質(zhì)控品分到相應(yīng)的背景組中后，使用軟件自動扣除其背景熒光值。

 

 

 

 

 

步驟3.把微孔板放到讀板機里后---確保紫色托架（適配器）放置在微孔板托架上---然后點擊Read讀板。

 

SoftMax Pro軟件中預(yù)置的IMAP 熒光偏振模板會自動計算出水平偏振均值和垂直偏振均值(mP值)，總的熒光強度，標(biāo)準方差和CV值。每一組試驗樣品的組群一欄中，模板會自動扣除背景樣品的熒光偏振值，然后計算出最小偏振mP值。也可根據(jù)相應(yīng)的校正曲線計算出樣品磷酸化比率。(See IMAP Application Note #4, “Developing calibration curves for IMAP”)

 

圖表2顯示了使用 FAM-p34cdc2多肽獲得的一條LCK激酶的稀釋度曲線。當(dāng)用SpectraMax M5微孔板讀板機檢測時，得出酶的濃度范圍從0.04至3.5 units/ml，最小偏振值為303，同時Z'因子的值為0.87。圖表3顯示了使用Analyst HT多功能讀微孔板讀板機檢測相同孔時，熒光偏振值為336，Z'因子的值為0.95。兩臺儀器得到的EC50值均為0.5 units/ml。

 

如果使用非磷酸化和磷酸化的多肽樣品作為質(zhì)控分別做一條校正曲線，可以將熒光偏振值以百分比形式顯示，得出其磷酸化程度。(See Figure 4.)首先建立一條新的曲線(軟件默認名稱為Graph#1)，分別使用熒光偏振值(mP值)相對磷酸化百分比(濃度)作為你的質(zhì)控樣品組繪制一條曲線。曲線默認名稱為“Plot#1.”在校正標(biāo)準品組欄里，新建一列后輸入下面的公式，即：

InterpX(‘Plot#1@ Graph#1@IMAP FP_FAM’,AvgbkgsubmP)。并用‘IMAP FP_FAM’作為試驗名稱。

 

為了確定使用紅色熒光染料進行IMAP激酶試驗的效果，另一個LCK激酶稀釋曲線結(jié)果的獲得來源于TAMRA-p34cdc2多肽。(See Figure 5.)使用SpectraMax M5微孔板讀板機檢測結(jié)果，酶的濃度范圍是從0.04到3.5 units/ml，熒光偏振值(mP值)為258 ， 同時Z ' 因子的值為0.95 。在Figure 6中，相同的試驗使用Analyst HT微孔板讀板機進行檢測后，熒光偏振值(mP值)結(jié)果為270，同時Z'因子的值為0.93。兩個讀板機得到的EC50值都為0.4units/ml，與FAM標(biāo)記的底物獲得結(jié)果相一致。同樣也建立了一條相關(guān)的校正曲線(See Figure 7.)，TAMRA和FAM相近的結(jié)果也可以讓用戶利用紅色熒光染料給我們帶來的優(yōu)勢，即能夠盡可能降低化合物產(chǎn)生的背景熒光。

 

 

隨著研究人員努力去探究激酶在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和各種疾病中扮演的角色，以及在許多疾病治療中發(fā)揮的調(diào)節(jié)機制，他們越來越希望獲得非放射性的、均相的檢測方法，可用于試驗優(yōu)化和高通量藥物的篩選。熒光偏振試驗可提供一種均相的、高通量的方式來鑒定各種激酶的激活劑、抑制劑和底物。使用SpectraMax M5多功能微孔板讀板機進行IMAP熒光偏振檢測：獲得的結(jié)果精確性高、重復(fù)好、Z'因子值高，雙光柵型單色器系統(tǒng)方便使用者選擇不同熒光染料標(biāo)記的多肽底物進行試驗優(yōu)化，而無需額外的在選購濾光片。此外，無論是用綠色或者紅色熒光染料標(biāo)記的底物進行IMAP熒光偏振激酶試驗，獲得的結(jié)果都與使用濾光片型單色器的微孔板讀板機上的檢測值相一致。最后，SoftMax Pro軟件上預(yù)設(shè)的IMAP 熒光偏振模板為熒光偏振數(shù)據(jù)的采集和分析提供了一種更為方便的方式，并且這些模板也可用于不同熒光染料分子的檢測。

 

1.IMAP Akt Assay Kit Product Insert(Molecular Devices product #R8058).

2.Developing calibration curves for IMAP(IMAP Application Note #4).

3.Zhang, J.H., Chung, T.D.Y., and Oldenburg,K.R. (1999). A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of highthroughput screening assays. J Biomol Screen 4 (2): 67-73.