酶標(biāo)儀準(zhǔn)確對焦與良好對準(zhǔn)結(jié)果的關(guān)系詳解

瀏覽次數(shù)：1157　發(fā)布日期：2024-1-17　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

用相機或手機拍照的時候，準(zhǔn)確對焦是出好片的關(guān)鍵。這一點其實同樣適用于酶標(biāo)儀中的光學(xué)系統(tǒng)！本文將介紹酶標(biāo)儀的焦距，以及這項設(shè)置對結(jié)果有何影響。在酶標(biāo)儀中，焦距（focal height）是指酶標(biāo)儀的探測系統(tǒng)與微孔板中樣品之間的距離。最佳對焦位置處于酶標(biāo)儀能檢測到樣品最高信號強度的平面。如果測量時沒有調(diào)好對焦，會對結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。

圖1：某酶標(biāo)儀的焦距曲線

不同型號的酶標(biāo)儀

之間有何區(qū)別

不同制造商生產(chǎn)的酶標(biāo)儀功能各異：有些不可調(diào)對焦，有些可能需要手動設(shè)置，有些可以自動調(diào)節(jié)。不能調(diào)節(jié)焦距的儀器通常是入門級設(shè)備，靈敏度有限。手動設(shè)置對焦的儀器需要反復(fù)試驗，根據(jù)經(jīng)驗確定某項測定的最佳焦距。具有自動對焦功能的酶標(biāo)儀可在測量前自動識別特定樣品或一組樣品的最佳焦距（圖1）。只要加液體積和微孔板類型保持不變，就可以使用上一次測定設(shè)置好的焦距。BMG LABTECH的多功能酶標(biāo)儀提供自動對焦選項，如CLARIOstar® Plus（圖2），同時也支持根據(jù)需要手動設(shè)置對焦。

圖2：BMG LABTECH的CLARIOstar® Plus提供多種不同的對焦設(shè)置選項

對焦設(shè)置

對信噪比的影響

受液體樣品物理特性的影響，信號強度通常在樣品液面稍下方達到最高。酶標(biāo)儀會通過識別信號強度最高的平面來確定最佳焦距。提高對焦的高度會使光學(xué)焦點移到液面上方；降低對焦的高度會使光學(xué)焦點向微孔板底部方向移動。在這兩種情況下，測出的信號強度都會降低，而來自背景噪音的信號則保持不變，這會導(dǎo)致信噪比（圖3）和assay window降低。

圖3：信噪比受對焦設(shè)置的影響

在上圖的例子中，設(shè)置不同焦距測量了100nM熒光團標(biāo)準(zhǔn)樣品和空白樣品，隨后計算出相應(yīng)的信噪比（S/B），并生成相對于焦距的曲線。自動調(diào)節(jié)得出的最佳焦距為9.3mm，對應(yīng)的是本次對比實驗中觀察到的最佳信噪比值。當(dāng)偏離確定的最佳焦距時，信噪比明顯下降。值得注意的是，不同應(yīng)用的最佳焦距取決于微孔板類型、加液體積和分析類型。比如在測量貼壁細(xì)胞樣本時，孔底部的信號強度最高。

對焦設(shè)置對數(shù)據(jù)變異

有何影響？

對焦設(shè)置不僅會影響測出的信號強度，還會影響數(shù)據(jù)變異（圖4），具體來說，設(shè)置不好會使重復(fù)樣品間的差異（%CV）增大，從而降低檢測結(jié)果的質(zhì)量。

圖4：對焦設(shè)置對數(shù)據(jù)變異的影響

對焦設(shè)置也會影響數(shù)據(jù)點的變異性。為了展示這一點，我們計算了在不同焦距下測量三等份100nM熒光團標(biāo)準(zhǔn)樣品的%CV值。如圖3所示，在酶標(biāo)儀確定的最佳焦距9.3處測量時，%CV值最低。在偏離最佳焦距時，變異系數(shù)增大。當(dāng)焦距低于最佳值時，%CV值的增加相對較小，但當(dāng)焦距高于最佳值時，%CV值會增加3%之多。

對焦取決于

加液體積

可以看出，準(zhǔn)確調(diào)整酶標(biāo)儀的焦距是獲得最佳結(jié)果的關(guān)鍵，但前提是必須將微孔板上各孔的加液體積差異保持在最小范圍內(nèi)。由于最佳焦距是根據(jù)一個樣品孔的填充體積確定的，因此，無論是無意中因移液錯誤還是有意中因移液體積不同而造成的差異，都會改變結(jié)果。正如下面的示例（圖5）所展現(xiàn)的，即使各孔之間的體積相差幾微升，也會導(dǎo)致測出信號強度的顯著變化。

圖5：微孔板中不同加液體積對熒光信號的影響

在此示例中，我們在樣品孔中移入了不同體積（10至30μL）的10nM熒光團標(biāo)準(zhǔn)液。在樣品體積為15μL的孔中進行對焦調(diào)節(jié)，之后使用所獲得的設(shè)置對所有樣品進行測量，測量數(shù)據(jù)相對于15μL孔中的數(shù)據(jù)進行歸一化處理。如圖5所示，在加液水平較低或較高的孔上使用15μL的最佳焦距會導(dǎo)致明顯的偏差。即使樣品量只有2.5μL的微小差異，也會導(dǎo)致20%的信號強度偏差。在某些情況下，這甚至?xí)䦟?dǎo)致信號增加，因為樣品體積較高的孔中含有的分析物總量更高。

轉(zhuǎn)載自：BMG LABTECH

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