常溫才是常道：生物樣品的常溫保存
摘要：
高質(zhì)量的生物樣品是組學(xué)研究和個性化醫(yī)療過程中臨床檢驗順利實施的前提。生物樣品的保存方式關(guān)系到待檢樣品的質(zhì)量和檢測的結(jié)果。樣品的適當(dāng)?shù)奶幚�、保存方式是最終獲取準(zhǔn)確測定結(jié)果必不可少的一環(huán)。常溫保存能耗少，環(huán)保，效費比較高，是一種有潛力的生物樣品保存方式。
正文：
生命科學(xué)領(lǐng)域高通量技術(shù)的發(fā)展促進了諸如基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組以及代謝組等各類組學(xué)的研究。相應(yīng)地，為了客觀、全面、完整地反映核酸、蛋白、代謝分子等研究對象各自的量以及彼此之間的相互關(guān)系，獲得高質(zhì)量的生物樣品是非常必要的。高質(zhì)量的生物樣品是組學(xué)研究和個性化醫(yī)療過程中臨床檢驗順利實施的前提。上海伯豪生物在多年提供組學(xué)研究技術(shù)服務(wù)的過程中，常常遇到樣品質(zhì)檢不過關(guān)的事例。不適當(dāng)?shù)臉悠诽幚怼⒈４婧凸芾矸绞綆淼慕Y(jié)果有時是災(zāi)難性的。對生物樣品的精準(zhǔn)采集、正確標(biāo)記很重要。除此之外，樣品的適當(dāng)?shù)奶幚怼⒈４娣绞揭彩亲罱K獲取準(zhǔn)確測定結(jié)果必不可少的一環(huán)。
談起生物樣品的保存，人們往往聯(lián)想到低溫。但生物樣品在常溫下，通過采取適當(dāng)?shù)姆绞�，也是可以保存較長時間的。常溫保存能耗少，環(huán)保，效費比較高，是一種有潛力的生物樣品保存方式。本文主要談?wù)勆飿悠返某乇４妗?/FONT>
一、 生物樣品常溫保存的幾種方式
目前生物樣品的常溫保存主要有以下四種方式。
1．福爾馬林固定石蠟包埋（formalin-fixed paraffin embedded, FFPE）是對動物組織及其所包含的生物大分子進行常溫保存的較常用的方法。福爾馬林的有效成分甲醛含有羰基基團，極性較強，化學(xué)與生物學(xué)活性強。它可使生物大分子發(fā)生交聯(lián)，加上后續(xù)的脫水步驟，整個過程破壞了引起核酸和蛋白等大分子降解的酶類的活性，因而被包埋的組織可以在常溫下保存。FFPE處理的樣品組織與細胞的形態(tài)學(xué)保持效果很好，多用于醫(yī)療機構(gòu)的組織病理學(xué)診斷和免疫組織化學(xué)檢測。在研究中也用于顯色原位雜交或熒光原位雜交。 FFPE包塊在常溫下可長時間保存，有的數(shù)十年后仍有使用價值。用這種方法保存核酸，得率不高，且片段化和交聯(lián)現(xiàn)象較嚴重。收獲的DNA一般長度不多于400bp，RNA長度不多于200bp。但也能滿足某些PCR、RT PCR或基因芯片雜交的要求。
由于福爾馬林有致癌性，且容易使核酸片段化，人們開發(fā)出一些福爾馬林替代物用于組織的固定。經(jīng)這些替代物固定后石蠟包埋的組織，收獲的核酸長度可達數(shù)千bp。
2．用穩(wěn)定液對組織及核酸進行常溫保存。這是一種簡便易行的生物樣品處理和保存方式，特別適用于動物組織樣品的短期處置。一些硫酸鹽類，在由緩沖劑調(diào)節(jié)的適當(dāng)?shù)膒H值范圍內(nèi)，可使某些核酸酶活性降低或喪失，從而保護大分子不被降解。這類穩(wěn)定液，可以迅速滲透組織和細胞，抑制核酸酶活性。將切下來的組織迅速切成尺寸不大于0.5cm的小塊，沒入5-10倍的穩(wěn)定液中。對于RNA來說，樣品可置于室溫（25℃）保存一周，4℃保存一月，-20℃長期保存。當(dāng)需要分離核酸時，將組織從穩(wěn)定液中取出，按常規(guī)進行后續(xù)操作即可。上海伯豪生物技術(shù)有限公司開發(fā)出的RNAsafetyTM組織RNA保存液，可用于這種類型的保存。實驗顯示，它對組織中RNA的保護效果明顯（見圖1 ）。采用RNAsafetyTM這類穩(wěn)定液，無需采用液氮或干冰轉(zhuǎn)送和運輸組織，便于操作，也節(jié)省材料費和運輸費。是值得采用的一種樣品處理和保存方式。
圖1. 用上海伯豪的RNAsafetyTM組織保存液保存大鼠肝臟組織（藍、紅、綠表示三個復(fù)本）。室溫放置兩周時，指示RNA完整性的RIN值仍在合格線（紅線）以上。
3． 采用干式化學(xué)穩(wěn)定基質(zhì)（包括高分子基質(zhì)）也可以保存核酸。FTA （Flinders Technology Associates）濾紙保存是其中的一種方式。FTA濾紙是一種多孔的纖維素基質(zhì)，經(jīng)由尿酸、非離子表面活性劑或強力變性劑以及螯合劑浸泡處理。當(dāng)樣品加到濾紙上時，細胞被裂解，核酸被釋放出來，吸附在濾紙上。濾紙上的化學(xué)物質(zhì)可使蛋白變性，酶活性喪失。載有核酸的FTA濾紙經(jīng)干燥，可以常溫保存核酸長達數(shù)年。目前FTA濾紙只可用于常溫保存DNA。
還有其它形式的干式保存基質(zhì)。它們由專利配方的、不同的化學(xué)物質(zhì)組合而成，可提供一種微環(huán)境，保護核酸不被氧化、水解或酶解，或者將核酸與熱源、紫外線隔離。這類基質(zhì)通常置于微孔板孔內(nèi)或試管內(nèi)。適量加入已抽提純化好的核酸樣品，樣品吸附在基質(zhì)上，干燥后可常溫保存。這種方法，只可分別保存DNA 或RNA，不宜將二者同時保存。椐推算，這類基質(zhì)可將核酸保存十多年。
4．將生物樣品冷凍干燥然后進行常溫保存。水分是降解酶類作用的條件之一。凍干可去除樣品中的水分，因而抑制酶的作用。凍干機通過制冷功能將樣品細胞間和細胞內(nèi)的水凍成冰，通過抽真空和升溫將冰升華，進一步提高溫度除去殘留的與組織或細胞結(jié)合的水分子。為了防止凍干品再次吸收空氣中的水分，可以將凍干后的樣品真空包裝，然后常溫保存。這樣也可抑制樣品的氧化和微生物的生長。核酸和蛋白樣品凍干后可保存1-4年。凍干RNA通常保存不超過一年。
二、 生物樣品常溫保存的優(yōu)勢
相比低溫保存，對生物樣品進行常溫保存有一些明顯的優(yōu)勢。首先是費用方面比較合算。樣品保存用的超低溫、深低溫冰箱的購置、維護保養(yǎng)和折舊費用往往相當(dāng)可觀。如果多個冰箱集中放置，還需要專用的空調(diào)房間來放置這些冰箱。為了防止供電故障或冰箱故障導(dǎo)致樣品被破壞，還需要備用發(fā)電設(shè)備或備用供電線路，以及備用干冰等物料。此外還可能需要配置溫度監(jiān)控和報警設(shè)備。如果用液氮保存，液氮罐的購置、液氮的補充也會產(chǎn)生不菲的費用。有人估計，一份腫瘤樣品，凍干保存一年的成本是3歐元，-80℃ 保存的成本是24歐元，液氮保存的成本是31歐元。低溫保存的樣品往往采用干冰運輸，干冰本身的購置費用以及干冰帶來的運輸重量增加也加大了成本。使用液氮還要顧及到安全問題。大的液氮罐屬于壓力容器，需要正確處置；液氮溫度極低（-196℃），操作失誤時可致凍傷。另一方面，使用冰箱對環(huán)境的影響也比較大。溫度越低，每年所需的二氧化碳的排放量越大。一般家用冰箱年需二氧化碳的排放量約為1700磅，-80℃冰箱為4000磅，而-150℃ 深低溫冰箱為15,000磅。
常溫保存對空間的利用效率比較高。低溫保存設(shè)備由于一些制冷、隔熱等部件的存在，有效的冷凍空間在整個設(shè)備所占空間的比例有時并不高；為了使冰箱正常制冷，冰箱之間需要有足夠的距離，以便排熱；為了方便取樣，液氮罐也不能做得太高。這些因素，都限制了低溫設(shè)備的空間利用效率，也加大了低溫保存的成本。樣品進行常溫保存時，不存在低溫部件對空間的占用，人們可以充分地對儲存空間進行合理調(diào)配與利用。
三、生物樣品的常溫保存是今后的發(fā)展方向
生物樣品常溫保存的推廣，目前受到一些客觀因素的限制。FFPE方法采用的福爾馬林，有致癌性，一些人望而生畏，不愿意采用這種方法，而且這種方法有些繁瑣。采用福爾馬林的安全替代物進行固定，會增加一些費用，在臨床認可上也存在著與現(xiàn)有條規(guī)不相適應(yīng)之處。而且，早期采用替代物固定的組織學(xué)效果相比用福爾馬林稍差一些。 隨著新一代測序等技術(shù)的發(fā)展，對核酸質(zhì)量的要求更為重要， 因此，盡管組織學(xué)固定效果的不盡理想，但由這些替代物固定的樣品可以提取出更高質(zhì)量的核酸（片段化程度較低）。它們的價值將會逐漸顯現(xiàn)的。更理想的、新型的福爾馬林的替代物需要進一步開發(fā)。
上述的幾種常溫保存方式，在保存生物樣品時，有些方面做不到兼顧。例如，F(xiàn)FPE樣品的酶活性受到了破壞；液態(tài)穩(wěn)定液對組織的常溫保存時間仍不夠長（通常一周）；干式化學(xué)穩(wěn)定基質(zhì)只能分別保存DNA或RNA，不能保存組織；凍干法可以保持組織的酶活性以及形態(tài)學(xué)特征，但對核酸（尤其是RNA）的保存時間不是太長（RNA保存不超過一年）。因此，需要根據(jù)取樣的目的，再決定采用哪種保存方式最合理。特別需要指出的是，組織穩(wěn)定液，例如上海伯豪生物技術(shù)有限公司開發(fā)出的RNAsafetyTM組織保存液，也可用于冰箱發(fā)生故障時生物組織樣品的應(yīng)急保存。
隨著諸多現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢測手段的應(yīng)用和個性化醫(yī)療的發(fā)展，基礎(chǔ)研究和臨床檢驗所收集的生物樣品的數(shù)量將是巨大的。對它們長期進行低溫保存將耗費不少資源和環(huán)境成本。開發(fā)出低成本的、符合組織學(xué)和現(xiàn)代遺傳學(xué)檢測要求的、可長期保存樣品的常溫保存方發(fā)將帶來巨大的效益。生物樣品的常溫保存將是今后的發(fā)展方向，因為這種方式節(jié)儉、環(huán)保。
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