看MRC的科學家如何快速、直接進行大分子結晶條件優(yōu)化

 

X-ray晶體學方法是目前獲得生物大分子結構的最有效手段。但是想要從純化的蛋白、核酸或是大分子復合物獲得晶體需要面臨巨大的挑戰(zhàn)。與繁復冗長的實驗設置和過程相伴的往往是極低的實驗成功率。首先，研究者會用購買商品化的試劑盒，在一個廣泛的范圍內對純化的樣品進行一輪結晶條件的初步篩選。然后，再根據(jù)具體的實驗情況進行一輪優(yōu)化篩選，以便重復和改善初步篩選時獲得的結果。通過優(yōu)化的條件，得到高質量的晶體，就可以獲得可靠的X-ray衍射數(shù)據(jù)，從何解析出高分辨率的結構。

 

通常，優(yōu)化篩選使用傳統(tǒng)的液體加樣器，由手工來完成。整個過程會非常地耗時。另外，常用的儲液含有低表面張力或是高粘度的組份，如PEGs。這些因素經(jīng)常會導致加樣不準確和交叉污染的發(fā)生。

 

MRC分子生物學實驗室的科學家使用英國TTP Labtech全新研發(fā)的全自動液體處理工作站—dragonfly，輕松克服了上述阻礙，全自動優(yōu)化得到了三種不同蛋白質樣本的結晶。這臺創(chuàng)新型的儀器使用固相置換技術和非接觸式加樣原理，不僅可以杜絕交叉污染的發(fā)生，對所有類型的液體（包括極其粘稠的甘油）當加樣精度達到1 μL級別時，CV值都控制在5%以內，確保準確加樣。研究人員可以在任意一種SBS加樣板中，快速簡便地制備自己需要的篩選條件。一塊包含96種篩選條件的加樣板，可以在3-6分鐘的時間內制備完成。

 

 

Lysosyme、Concanavalin A以及Catalase的蛋白樣品按照報道的方法進行準備，并完成了初步篩選。

 

按照不同蛋白得到的初步篩選條件，沉淀劑（PEG）和添加劑（如：propanediol）的濃度以對角線梯度的方式升高或是降低，從而進一步優(yōu)化篩選條件。這樣的加樣方式可以在結晶板內產生兩種不同試劑的濃度梯度，每個孔內所需要添加的不同儲液量都會自動依次分配。每種蛋白都會嘗試3種不同的pH條件，用dragonfly準備9塊含有不同篩選條件的加樣板。

 

將這9塊篩選板放在水平搖床上混勻，用mosquito直接進行蛋白溶液和篩選液的混合加樣（100 nL + 100 nL）。每天進行培養(yǎng)觀察，三周后獲得了生長出的晶體照片。

 

 

每塊優(yōu)化篩選板的準備時間都不超過4.5分鐘。經(jīng)過7天得培養(yǎng)，每塊板中都可以觀察到3到15個孔內有晶體生長。

 

晶體成核和生長的條件都通過調節(jié)溶液的濃度和pH值的方法進行優(yōu)化。通過這種方式，獲得了大量的單個大體積的晶體。結構解析和配體結合的研究過程中，往往會發(fā)生嚴重的晶體丟失的現(xiàn)象。大量晶體的獲得可以克服這個研究的瓶頸。

 

 

dragonfly已被證明可以快速有效地在96孔內完成結晶條件的制備工作。與傳統(tǒng)的手工加樣相比，dragonfly制備優(yōu)化篩選條件的速度提高了至少3倍。

 

dragonfly采用的固相置換和非接觸式加樣技術確保了任意黏度液體的加樣準確性，同時還杜絕了交叉污染的發(fā)生。儀器的設置和運行十分簡單便捷，不需要復雜的培訓就可以讓不同的使用者獨立進行實驗操作。伴隨著實驗的成功，用dragonfly配制優(yōu)化篩選條件已經(jīng)成為了MRC分子生物學實驗室進行進行篩選的日常實驗手段。使MRC的科學家可以快速、直接進行大分子結晶條件優(yōu)化。

 

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