戊巴比妥鈉和異氟烷對大鼠急性應(yīng)激反應(yīng)的影響

研究背景：麻醉后處死動物在應(yīng)激方面的研究是普遍的，但是麻醉對結(jié)果的影響研究不足。我們的目的是探究不同麻醉劑的影響，如在大鼠急性應(yīng)激反應(yīng)時腹腔注射戊巴比妥鈉或吸入異氟烷。

方法：將大鼠隨機(jī)分為電擊（FS）和非應(yīng)激對照組，進(jìn)一步設(shè)定處死程序：直接斬首，腹腔注射戊巴比妥鈉或吸入異氟烷后斬首。再設(shè)定一組對照組腹腔注射生理鹽水后斷頭處死。測定血漿皮質(zhì)酮（CORT），睪酮和雌二醇，下丘腦應(yīng)激相關(guān)分子表達(dá)的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素，血管加壓素和催產(chǎn)素，與額葉相關(guān)分子表達(dá)的NMDA受體NR2B亞單位，GABAA受體和神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿受體。

結(jié)果：直接斬首組和異氟烷電擊（FS）顯著增加血漿皮質(zhì)酮（CORT），而腹腔注射戊巴比妥鈉注射后，這種應(yīng)激反未出現(xiàn)。非應(yīng)激對照組動物，無論是注射生理鹽水還是戊巴比妥鈉都引起的血漿皮質(zhì)酮（CORT）顯著增加。各組間性激素水平和大腦中的相關(guān)分子mRNA的表達(dá)差異顯著。

結(jié)論：混合注射麻醉導(dǎo)致動物應(yīng)激反應(yīng)，妨礙了血漿皮質(zhì)酮（CORT）水平，但影響血漿性激素水平和大腦mRNA的表達(dá)。異氟烷吸入應(yīng)激反應(yīng)影響較少，而且從實(shí)驗(yàn)動物倫理的角度來看，也是最理想的。

1.簡介
應(yīng)激反應(yīng)與情感性精神障礙病因?qū)W的關(guān)系[ 1 ]促進(jìn)了動物模型應(yīng)激反應(yīng)的研究。壓力調(diào)節(jié)系統(tǒng)如下丘腦-垂體-腎上
腺（HPA）軸活動已在不同的應(yīng)激活動下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）活性研究是由促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）驅(qū)動的物質(zhì)主要來自下丘腦室旁核（PVN）的下丘腦。HPA軸的最終目標(biāo)的壓力荷爾蒙激素，這主要是在大鼠皮質(zhì)酮（CORT）。我們和其他組發(fā)現(xiàn)性激素如睪酮（T）、雌二醇（E2）和神經(jīng)肽，如精氨酸加壓素（AVP）和催產(chǎn)素（OXT），在壓力反應(yīng)[ 2 ]起重要調(diào)節(jié)作用。

處死動物的方式來研究可能的混淆作用引起了我們的關(guān)注。相關(guān)的生物學(xué)研究處死動物一般有兩種方法：直接斷頭或給藥后麻醉斷頭。斷頭可能是一個潛在的額外的壓力，這也取決于研究者的經(jīng)驗(yàn)，會影響研究結(jié)果[ 3 ]。無意識的麻醉藥似乎減少了額外的壓力[ 4 ]。然而，一些藥物，如苯巴比妥，也會引起額外的應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為增加血漿CORT水平[5,6]。此外，麻醉劑影響興奮性受體抑制大腦的活動，包括N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體NR2B亞單位與神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿受體（nnachr），通過抑制受體刺激如GABAA受體（GABAAR）[ 7 ]。到目前為止是否經(jīng)常使用麻醉劑如腹腔注射（ip）戊巴比妥鈉或異氟烷吸入可能影響大鼠腦mRNA表達(dá)與在急性應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的分子，也不清楚腹腔注射戊巴比妥鈉如何引起動物的附加應(yīng)激。

因此我們分析了經(jīng)驗(yàn)豐富的研究員用不同方式處死動物的影響，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉和吸入異氟烷后電擊（FS）和不刺激對照組比較，比較內(nèi)容包括血漿CORT，T和E2水平，下丘腦CRH mRNA水平，AVP和OXT，與額葉NMDA-NR2B、 GABAAR、 mRNA和nnAChR的表達(dá)水平。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1 倫理陳述
所有動物使用和實(shí)驗(yàn)均按照實(shí)驗(yàn)動物的使用和保護(hù)指南(National Research Council, 1996, USA)，經(jīng)中國國家委員會浙江分會批準(zhǔn)。盡最大努力來減少動物的痛苦，并盡可能少用動物（更多細(xì)節(jié)見補(bǔ)充材料1）。

2.2 電擊大鼠
雄性SD大鼠（體重300-330g），飼養(yǎng)在25-27℃房間，12h明暗交替，自由攝食飲水。給予一周時間適應(yīng)環(huán)境。擬定0.5mA電刺激5s，然后間隔25min。動物居住條件和衛(wèi)生細(xì)節(jié)連同F(xiàn)S協(xié)議見輔助材料1.將大鼠隨機(jī)分為7組：1）對照或2）FS通過直接斷頭處死大鼠（分別為黃連解毒湯，F(xiàn)SD）；3）控制或4）腹腔注射3.5%戊巴比妥鈉（3ml/kg）5分鐘后FS大鼠斷頭處死（分別為和FSP）；5）對照或6）4%異氟醚在吸氧后1–2分鐘FS大鼠斷頭處死（綜合技術(shù)研究所或FSI組）；7）額外的對照組腹腔注射生理鹽水（3毫升/公斤）5分鐘后斷頭處死（CTR）。每組7只或8只大鼠。由相同的研究人員，電擊（FS）30分鐘內(nèi)處死動物，實(shí)驗(yàn)在每日15:00-16:00之間。采血、離心、收集血漿。迅速取出大鼠大腦、下丘腦和額葉進(jìn)行解剖。根據(jù)Paxinos和Watson的圖集[ 10 ]下丘腦解剖位置是前囟點(diǎn)1.7mm。
所有的樣品都是立即凍結(jié)并存儲在−80°C直到進(jìn)行檢測。所有程序均符合當(dāng)?shù)貏游锉Ｗo(hù)委員會的有關(guān)規(guī)定和法律。

2.3 血漿激素水平測定
采用酶聯(lián)免疫法測定血漿CORT水平(RE52211, IBL Corporation, Germany)。變異(CV)的內(nèi)和間變異系數(shù)分別為3.38%和10.50%。用放射免疫分析法檢測血漿T水平(IM1087, Immunotech Corporation, USA)，一個內(nèi)和批間CV分別為2.6%和11.9%。通過酶聯(lián)免疫試劑盒測定血漿E2水平(ADI-900-174, Enzolifesciences Corporation, USA)，一個內(nèi)和跨3.9%和11.37%的CV，分別。

2.4 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）在下丘腦和額葉的mRNA表達(dá)分析
對下丘腦CRH，AVP mRNA與額葉NR2B，GABAAR和nnachr表達(dá)水平的檢測方法是光電導(dǎo)繼電器Q-PCR�？傊�，全部 RNA用Trizol提取劑和基因與PrimeScript RT試劑盒合成。Q-PCR采用Bio-Rad cfx96觸摸熒光PCR儀進(jìn)行比[ 11 ]。所有的程序都是按照制造商的指示進(jìn)行的。引物對CRH，AVP，OXT，NR2B，GABAAR-受體，nnachr和β肌動蛋白mRNA設(shè)計與程序Primer Premier 5。作為管家基因（見輔助材料2）

2.5 統(tǒng)計
當(dāng)數(shù)據(jù)被發(fā)現(xiàn)是不是正態(tài)分布，采用非參數(shù)測試。多組比較，第一–沃利斯試驗(yàn)采用Kruskal，如果有顯著性差異，組間比較進(jìn)一步進(jìn)行–Mann Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為是重要的。

3. 結(jié)果

3.1 血漿激素水平
FSD組血漿激素明顯升高（P＜0.001），但是和CTRD組相比T檢驗(yàn)（P=0.834）或E2 levels（P=0.248）無顯著差異。     
類似結(jié)果被觀察到，當(dāng)FSI組和CTRI組相比較，血漿CORT水平顯著升高（P＜0.001）。血漿T（P=1.000）和E2 Levels（P=0.563）沒有出現(xiàn)明顯的變化。相比之下，F(xiàn)SP集團(tuán)并未顯示血漿CORT顯著變化（P = 0.132），T（P = 0.848），或E2水平（P = 0.949）與CTRP組比較（圖1）。此外，兩CTRP（P = 0.008）和點(diǎn)擊率（P = 0.004）組明顯高于血漿CORT水平比CTRD組，而綜合技術(shù)研究血漿CORT水平（P = 0.248）與CTRD組比較未顯示出有顯著差異（圖1）。

圖1

3.2 下丘腦和額葉相關(guān)分子表達(dá)
在電擊FS刺激處死大鼠實(shí)驗(yàn)無任何組在下丘腦CRH，AVP mRNA表達(dá)和催產(chǎn)素或額葉NR2B，GABAAR，和nnachr有顯著性差異（圖2）。

圖2

4. 討論
目前研究表明，斷頭前腹腔注射戊巴比妥顯著增加基礎(chǔ)血漿CORT水平，這可能會影響研究結(jié)果。另一方面，斷頭前異氟烷吸入麻醉不影響基礎(chǔ)血漿CORT水平。事實(shí)上，生理鹽水腹腔注射對照組增加基礎(chǔ)血漿CORT水平，表明是腹腔注射而不是戊巴比妥造成額外的刺激。我們還發(fā)現(xiàn)，麻藥的使用，即腹腔注射戊巴比妥和吸入異氟烷，電擊FS 30min后不干擾測量腦應(yīng)激相關(guān)mRNA分子表達(dá)。

我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)S后直接斷頭處死大鼠或吸入異氟烷后斷頭處死大鼠顯著增加血漿CORT水平，這與之前的研究是一致的[ 12 ]。然而，由于在非FS組皮質(zhì)醇水平升高，這種應(yīng)激反應(yīng)在腹腔注射戊巴比妥鈉注射液組沒有出現(xiàn)。由于腹腔注射戊巴比妥鈉和腹腔注射生理鹽水造成的對照組血漿CORT相似的增長，而額外增加血漿CORT水平在異氟烷組或直接斷頭對照組未出現(xiàn)，額外的應(yīng)激明確是來自注射本身，而不是對戊巴比妥鈉化合物的效果，混淆了結(jié)果。應(yīng)該指出的是，F(xiàn)S電擊雄性SD大鼠20min后我們沒有觀察到血漿中T、E2水平或下丘腦CRH，AVP和oxtmrna水平或在額葉皮層NR2B， nnachr GABAA受體mRNA的表達(dá)顯著差異。在某些區(qū)域的某些相關(guān)分子的表達(dá)可能沒有回應(yīng)，直到30分鐘或更多的雄性SD大鼠的應(yīng)激后。在下丘腦PVN CRH mRNA開始明顯增加，2 h和1 h的AVP mRNA開始增加約束應(yīng)力[ 13 ]出現(xiàn)，雖然2小時固定[ 14 ]后OXT mRNA沒有顯示變化，可4小時腹腔注射高滲鹽水后顯著增加[ 15 ]。這些數(shù)據(jù)可以解釋在我們的研究中觀察到的與應(yīng)激有關(guān)的分子改變mRNA的表達(dá)。應(yīng)當(dāng)指出，然而，那其他一些分子mRNA的表達(dá)，如黑皮質(zhì)素受體亞型4（MC4R）和阿黑皮素原，表明雄性SD大鼠下丘腦顯著增加，在30分鐘內(nèi)從一個類似的FS電擊刺激開始，在杏仁核的[ 16 ] CRH mRNA和MC4R基因mRNA表達(dá)明顯增加，說明FS引發(fā)變化的分子和腦區(qū)時相關(guān)的。

我們數(shù)據(jù)表明，電擊30min后，斷頭前麻醉大鼠不影響下丘腦和額葉相關(guān)分子血漿激素水平或mRNA的表達(dá)，但實(shí)施方式可能影響血漿CORT水平，異氟烷吸入后斷頭似乎維持應(yīng)激反應(yīng)的完整，而且從倫理學(xué)角度也是應(yīng)激反應(yīng)研究的最佳選擇。