IAC-SEP®黃曲霉毒素總量免疫親和柱IAC103使用說明書

IAC-SEP®黃曲霉毒素總量免疫親和柱

（產(chǎn)品編號(hào)：IAC103）

使用對象

IAC-SEP®黃曲霉毒素總量免疫親和柱能夠特異性的純化與濃縮樣品中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2。黃曲霉毒素免疫親和柱廣泛地應(yīng)用于糧食、食品、飼料、堅(jiān)果、花生、醬油、醋、辣椒、胡椒、藥材和酒類等樣品的提取，該方法速度快、操作簡單、準(zhǔn)確性高，對準(zhǔn)確靈敏的測定樣品中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2起到十分重要的作用。

IAC-SEP®黃曲霉毒素總量免疫親和柱適用于以下標(biāo)準(zhǔn)：

GB/T 18979-2003 食品中黃曲霉毒素的測定-免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法

SN/T 1101-2002 進(jìn)出口油籽及糧谷中黃曲霉毒素的檢測方法

原理

樣品經(jīng)甲醇+水提取液提取、過濾、稀釋，然后通過鍵合有黃曲霉毒素特殊抗體的免疫親和柱。此時(shí)，黃曲霉毒素被親和柱中的抗體特異性的吸附，用水或緩沖液將免疫親和柱上的雜質(zhì)除去，然后用甲醇使抗體變性，從而將黃曲霉毒素從親和柱上洗脫下來。最后，用HPLC或熒光計(jì)進(jìn)行定量檢測。

儲(chǔ)存條件

該親和柱保存在2-8 °C條件下，絕對不能冷凍，保質(zhì)期為18個(gè)月。建議在室溫（18-30°C）下使用。

實(shí)驗(yàn)溶液制備

提取液，甲醇/水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水，混合均勻。

        甲醇/水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水，混合均勻。

 HPLC流動(dòng)相，甲醇/水（45+55）：取450mL甲醇加550mL水，混合均勻，用0.22微米的尼龍篩過濾。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取黃曲霉毒素混標(biāo)（G1010，B1和G1為1.0ug/mL,B2和G2為0.3ug/mL），流動(dòng)相為稀釋液，配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液。例如：取100uL標(biāo)準(zhǔn)品原液于10mL容量瓶中，用10mL流動(dòng)相定容至10mL，那么，黃曲霉毒素B1和G1為10ng/mL，黃曲霉毒素B2和G2為3ng/mL

注：配制好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液2-8℃冷藏保存有效期為24h

pH 7.0 PBS溶液：稱取8.0g氯化鈉，1.44g磷酸氫二鈉，0.24g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，用990mL純水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，最后用純水稀釋至1000mL

0.1%的吐溫/PBS：將1.0mL吐溫-20加入到1L pH 7.0 PBS溶液中，混勻。

液相色譜條件

色譜柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5um）或4.6*250mm（5um）

流動(dòng)相：甲醇-水（45+55，v/v）

流速：0.8mL/min

檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長360nm,發(fā)射波長440nm

進(jìn)樣體積：20~100uL

光化學(xué)衍生化系統(tǒng)：光化學(xué)衍生器（連接于色譜柱后，然后通向熒光檢測器）

分析步驟

1.樣品提取及稀釋：

大米、玉米、小麥、堅(jiān)果、調(diào)料、花生及其制品：準(zhǔn)確稱取試樣25.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及準(zhǔn)確加入125.0mL甲醇-水（7+3），以均質(zhì)器高速攪拌提取2min。槽紋濾紙過濾，準(zhǔn)確移取15.0mL濾液并加入30.0mL水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用。

 植物油脂：準(zhǔn)確稱取試樣25.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及入125.0mL甲醇-水（7+3），以均質(zhì)器高速攪拌提取2min。槽紋濾紙過濾，準(zhǔn)確移取15.0mL濾液并加入30.0mL水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用。

 醬油：稱取試樣50.0g于250.0mL具塞錐形瓶中，加入2.5g氯化鈉及加入甲醇-水（8+2）至100.0mL，以均質(zhì)器高速攪拌提取1min。槽紋濾紙過濾，準(zhǔn)確移取10.0mL濾液并加入40.0mL水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用。

 食醋：準(zhǔn)確稱取5.0g樣品，加入1.0g氯化鈉，以pH7.0磷酸鹽緩沖溶液稀釋至25.0mL，混勻，定量濾紙過濾。取10.0mL濾液加入10.0mL pH7.0磷酸鹽緩沖溶液，混勻。以玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用。

 飼料：準(zhǔn)確稱取試樣50.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及入100.0mL甲醇-水（8+2），以均質(zhì)器高速攪拌提取2min。槽紋濾紙過濾，準(zhǔn)確移取10.0mL濾液并加入40.0mL pH7.0 PBS稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，備用。

2.樣品的凈化

   黃曲霉毒素總量免疫親和柱的柱容量(最大吸附黃曲霉毒素量)為300ng，當(dāng)樣品中黃曲霉毒素超過測定范圍時(shí)，請適當(dāng)減小上柱體積，使其在檢測范圍內(nèi)，計(jì)算出準(zhǔn)確含量。

 大米、玉米、小麥、堅(jiān)果、調(diào)料、花生及其制品、植物油脂：（測定范圍0-300 μg/kg）

    將免疫親和柱連接于20.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取15.0mL樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約2mL/min（1滴/秒）流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入1.0mL色譜級(jí)甲醇洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

 醬油和食醋：（測定范圍0-300 μg/kg）

 將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取10mL樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約2mL/min（1滴/秒）流速緩慢通過免疫親和柱。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL 0.1%的吐溫/PBS清洗，再以10.0mL水清洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2 mL~3mL空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入1.0mL色譜級(jí)甲醇洗脫，流速為1mL/min~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

 飼料：（測定范圍0-300 μg/kg）

將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取10mL樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約2mL/min（1滴/秒）流速緩慢通過免疫親和柱。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水清洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2 mL~3mL空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入1.0mL色譜級(jí)甲醇洗脫，流速為1mL/min~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

高效液相色譜儀檢測黃曲霉毒素B1, B2, G1, G2的標(biāo)準(zhǔn)譜圖

注意事項(xiàng)

1. 樣品添加回收試驗(yàn)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品添加到樣品中，靜置2小時(shí)后或過夜，再進(jìn)行樣品前處理，否則會(huì)出現(xiàn)回收率偏低的現(xiàn)象。
2. 不要隨便更改操作說明書中的操作步驟，如需更改要和本公司技術(shù)部聯(lián)系，確認(rèn)更改是否合理。
3. 操作步驟中，樣品過柱，淋洗，洗脫時(shí)，一定要控制好流速，不能太快，否則會(huì)使檢測結(jié)果偏低。
4. 如果將標(biāo)準(zhǔn)品直接過柱驗(yàn)證回收率時(shí)，一定要確保標(biāo)準(zhǔn)上柱液中甲醇濃度不要超過25%，否則會(huì)影響柱子的吸附能力。
5. 試驗(yàn)中使用的玻璃儀器等，一定要清洗干凈，尤其是用次氯酸等處理過的儀器，否則會(huì)使檢測結(jié)果偏低。

需要準(zhǔn)備的設(shè)備及試劑（中檢維康提供）