tRF&tiRNA：為什么以及如何研究它們？

概述
    轉(zhuǎn)運RNA (tRNA)是一種參與解碼mRNA、翻譯蛋白質(zhì)的接頭分子。近年來的研究表明tRNA還能作為小非編碼RNA (sncRNA)的主要來源之一，具有獨特且多樣的功能1。這些tRNA來源的ncRNA并非隨機降解的產(chǎn)物，而是通過精確的生物發(fā)生過程產(chǎn)生的 (圖.1) 。源自tRNA的ncRNA大致分為兩大類：tiRNA (或者tRNA halves) 和tRFs (tRNA 衍生片段) ，具有其特定的分子大小、核苷酸組成、生理功能以及生物發(fā)生^1-3。
   
    tRNA halves (tiRNAs)是由angiogenin (ANG)在多種應(yīng)激條件下在成熟tRNA的反密碼子環(huán)處特異性切割產(chǎn)生的5’-和3’- tRNA半分子，長度約為29-50nt。
 
    tRFs長度約16-28nt，來源于成熟tRNA或前體tRNA，根據(jù)其在tRNA上的對應(yīng)位置可進(jìn)一步分為：(i) tRF-5，對應(yīng)成熟tRNA的5’端，切割發(fā)生在D-loop；(ii) tRF-3，對應(yīng)成熟tRNA的3’端，包含CCA部分，切割發(fā)生在T-loop；(iii) tRF-1，源自前體tRNA的3’尾部序列，3’末端含有多聚U序列；(iv) i-tRF，不屬于tRF-5，tRF-3或tRF-1，主要來自成熟tRNA的中間區(qū)域。
      
圖1. tRF&tiRNA的生物發(fā)生過程。tRF-1產(chǎn)生于前體tRNA的3’尾端序列。tRF-5，i-tRF和tRF-3分別起源自成熟tRNA的5’、內(nèi)部、和3’端。當(dāng)切割發(fā)生在成熟tRNA反密碼子環(huán)，將產(chǎn)生兩個半分子，tiRNAs，包括5’-tRFs和3’-tRFs。
 
生物功能
    tRFs和tiRNAs作為sncRNA執(zhí)行多種生物學(xué)功能 (圖7) 。它們能夠作為miRNA行使RNA干擾(圖2) ；替換與mRNA結(jié)合的翻譯起始因子eIF4G，直接抑制蛋白的翻譯過程^4,5；結(jié)合某些蛋白因子，例如YBX1，影響mRNA的穩(wěn)定性 (圖3) ；與細(xì)胞色素C相互作用，調(diào)控細(xì)胞凋亡⁶；在應(yīng)激條件下促進(jìn)應(yīng)激顆粒 (Stress Granules, SGs) 的組裝 (圖4) ；敏化細(xì)胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的p53激活以及p53依賴的細(xì)胞死亡⁷；作為父代表觀遺傳因子，改變子代基因轉(zhuǎn)錄級聯(lián)過程^8,9 (圖6)
              
圖2.  tRFs具有許多microRNA的功能特性，例如，Dicer依賴的生物發(fā)生，與Argonaute蛋白形成RISC復(fù)合體以及RNA沉默。某些收錄的miRNA直接與tRFs匹配 ¹⁰。

圖3.  tRFs或者其類似物替換腫瘤基因mRNA結(jié)合蛋白YBX1，使許多促癌基因mRNA不穩(wěn)定，進(jìn)而癌細(xì)胞的浸潤性被顯著抑制 ¹¹。
      
圖4.  在細(xì)胞應(yīng)激條件下，tRNA halves (tiRNAs)由angiogenin 切割tRNA產(chǎn)生，隨后促進(jìn)Stress Granules (SGs)的組裝，誘導(dǎo)翻譯抑制，細(xì)胞修復(fù)和存活 ¹²。
 
人類疾病
    tRFs&tiRNAs與多種病理狀況相關(guān)，甚至是致病因素，例如，癌癥、神經(jīng)退行性疾病、遺傳性代謝疾病等 (圖5)。

 
圖 5.  tRFs&tiRNAs 分子功能和人類疾病。

癌癥
    tRFs&tiRNAs在多種癌細(xì)胞系中差異表達(dá)，例如前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和C4-2等。tRFs&tiRNAs在應(yīng)激條件下表達(dá)水平升高，尤其是在缺氧等氧化應(yīng)激條件下¹³。此外，一種在B細(xì)胞淋巴癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的tRF-3具有前導(dǎo)RNA的功能特性，以miRNA的方式抑制細(xì)胞增殖，調(diào)控DNA損傷應(yīng)答 ¹⁴。通過競爭YBX1結(jié)合位點、降低腫瘤基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物穩(wěn)定性，tRFs&tiRNAs可作為腫瘤抑制物 ¹¹ (圖. 3)。一種來自tRNA-Ser前體的tRF-1 (tRF-1001) 在多種癌細(xì)胞系中高表達(dá)，并且是前列腺癌細(xì)胞增殖所必須的 ¹⁵。ANG產(chǎn)生的tiRNAs促進(jìn)SGs的組裝，幫助細(xì)胞在不利條件下存活，據(jù)推測，ANG誘導(dǎo)的tiRNAs直接貢獻(xiàn)于ANG介導(dǎo)的血管生成和癌細(xì)胞增殖。類似的，tiRNAs能夠結(jié)合細(xì)胞色素C，并幫助癌細(xì)胞逃避細(xì)胞調(diào)亡 ⁶。綜上所述，這些重要發(fā)現(xiàn)強烈預(yù)示了tRFs&tiRNAs在腫瘤發(fā)生過程中的關(guān)鍵作用。

獲得性代謝疾病
    不斷增長的證據(jù)表明，子代的代謝疾病可源自親本的飲食習(xí)慣。在一個父本高脂飲食 (HFD) 小鼠模型中的研究顯示，精子中存在一類主要來自tRNA 5’端、長度在30-34nt的tRFs&tiRNAs，在高脂飲食條件下表現(xiàn)出差異表達(dá)和RNA修飾變化。將HFD小鼠精子中的tRFs&tiRNAs組分注射到正常受精卵中，可引起F1小鼠的代謝疾病，改變早期胚胎和胰島細(xì)胞代謝通路基因表達(dá)譜，并且獨立于CpG富集區(qū)DNA甲基化機制。因此，精子tRFs&tiRNAs代表著一類親本的表觀遺傳因子，介導(dǎo)飲食誘導(dǎo)的代謝疾病向子代遺傳 ⁸ (圖. 6)。
   
    限制小鼠飲食蛋白水平能夠改變小鼠成熟精子中小RNA含量，let-7表達(dá)降低，而Glycine tRNA 來源的5’ 端tRFs&tiRNAs表達(dá)量升高。tRFs&tiRNAs被認(rèn)為在著床前胚胎轉(zhuǎn)錄組表達(dá)調(diào)控中起著內(nèi) 源逆轉(zhuǎn)錄驅(qū)動作用⁹。
          
圖 6. 高脂飲食 (HFD) 小鼠精子中tRNA 來源的小RNA (tsRNAs，主要是tRNA halves) 具有變化的表達(dá)譜和RNA修飾。通過受精卵注射技術(shù)，tRFs&tiRNAs賦予了子代代謝疾病表型。這些表觀遺傳因子通過改變從胚胎到成年的基因級聯(lián)轉(zhuǎn)錄過程來介導(dǎo)親本到子代的遺傳過程 ⁸。

神經(jīng)性病變
    許多神經(jīng)性病變是由tRNA代謝或tRNA加工酶缺陷造成的。一種RNA酶活性降低的ANG突變體與致死性神經(jīng)退行性病變Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) 的病理過程相關(guān)聯(lián) ¹⁶。一類ALS相關(guān)的ANG突變體同時還在Parkinson’s Disease (PD)病人中發(fā)現(xiàn) ¹⁷。隨著研究的不斷深入，ANG誘導(dǎo)的tRNA halves與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)發(fā)育疾病之間的聯(lián)系得到進(jìn)一步加強 ¹⁸。CLP1 RNA激酶活性喪失，導(dǎo)致一種異常加工的酪氨酸t(yī)RNA前體來源的小RNA片段的積累，進(jìn)而敏化細(xì)胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的p53激活和p53介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡，誘發(fā)運動神經(jīng)元丟失，肌肉去神經(jīng)化以及呼吸衰竭 ⁷。另外一個案例是，5-胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶NSun2的突變引起的頭小畸形 (microcephaly)和其他神經(jīng)性異常。在NSun2缺失突變體大腦皮層、海馬和紋狀體神經(jīng)元中，tRNA 胞嘧啶5位甲基化的缺失，增強ANG對tRNA的結(jié)合和剪切，導(dǎo)致5’-halves的積累，進(jìn)而降低蛋白翻譯速率，激活應(yīng)激通路，減小細(xì)胞體積，促進(jìn)細(xì)胞凋亡¹⁹。

病理應(yīng)激損傷
    由缺氧、營養(yǎng)匱乏、氧化及代謝失衡等引起的應(yīng)激反應(yīng)能夠損傷細(xì)胞，催生疾病。這些應(yīng)激條件刺激tRNA halves的產(chǎn)生。在毒性損傷、輻射以及缺血再灌注等組織損傷動物模型中，tRNA halves的產(chǎn)生與組織損傷程度呈現(xiàn)相關(guān)性，例如，應(yīng)激導(dǎo)致tRNA構(gòu)象改變，隨后促進(jìn)ANG介導(dǎo)的tRNA halves的產(chǎn)生 ¹。5’-halves的表達(dá)上調(diào)與病毒及立克次體感染顯著相關(guān)，可能與抑制凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活有關(guān)。tRFs&tiRNAs、主要是30-35nt長的5’ halves在非惡性肝臟中具有高的表達(dá)量，而且在慢性病毒性肝炎中表達(dá)水平迅速上升¹⁸。

生物標(biāo)志物潛力
    tRFs&tiRNAs的組成和數(shù)量高度依賴于細(xì)胞類型和疾病狀態(tài) ²⁰。特別的，tRNA和tRF&tiRNA類群高度富集與生物體液中，有時甚至高于miRNA的含量 ^13,21,22。盡管目前對體液型生物標(biāo)志物的篩選主要集中在miRNA上，但是，tRFs&tiRNAs在多種體液中的高當(dāng)量高穩(wěn)定性，在病理過程中的廣泛參與，在實體瘤和血液惡性腫瘤中的差異表達(dá)，以及在癌癥病人和正常對照之間的強大分辨能力，為人們嘗試開發(fā)低侵入性的、基于tRFs&tiRNAs的生物標(biāo)志物開辟了廣闊的前景。例如，PLS-DA分析發(fā)現(xiàn)tRFs&tiRNAs的表達(dá)譜能夠清楚的分辨三陰(陽)性乳腺癌與正常對照 ²⁰ (圖7B，C)；研究顯示，不同tRFs&tiRNAs之間的比例關(guān)系能夠作為一個高效的癌癥無進(jìn)展生存期 (PFS) 指標(biāo)和診斷標(biāo)志物候選者 ¹³。
    
圖7. (A)血漿中存在豐富的tRNA衍生片段RNA21。在PLS-DA判別分析中tRFs&tiRNAs表達(dá)譜能夠清晰的分辨三陽性乳腺癌 (B)以及三陰性乳腺癌 (C)與健康對照。

如何研究tRFs&tiRNAs
    康成生物的tRF&tiRNA–seq服務(wù)系統(tǒng)對tRF&tiRNA進(jìn)行定性定量的表達(dá)譜分析，同時對tRF&tiRNA亞家族及未知tRF&tiRNA進(jìn)行鑒定。借助豐富的數(shù)據(jù)和信息，那些差異表達(dá)的tRFs&tiRNAs能夠被鑒定，并使用圖示的方法進(jìn)行下一步的深入研究 (圖. 8) 。許多已經(jīng)建立好的方法都和miRNA類似，例如，qPCR驗證，LNA寡核苷酸基因敲除，合成的類似物進(jìn)行功能獲得性研究等。

圖8. tRF&tiRNA下一步研究技術(shù)路線。

參考文獻(xiàn)

1.  Anderson, P. & Ivanov, P. tRNA fragments in human health and disease. FEBS letters 588, 4297-4304, doi:10.1016/j.febslet.2014.09.001 (2014).
2.  Pliatsika, V., Loher, P., Telonis, A. G. & Rigoutsos, I. MINTbase: a framework for the interactive exploration of mitochondrial and nuclear tRNA fragments. Bioinformatics, doi:10.1093/bioinformatics/btw194 (2016).
3.  Zheng, L. L. et al. tRF2Cancer: A web server to detect tRNA-derived small RNA fragments (tRFs) and their expression in multiple cancers. Nucleic acids research, doi:10.1093/nar/gkw414 (2016).
4. Gebetsberger, J., Zywicki, M., Kunzi, A. & Polacek, N. tRNA-derived fragments target the ribosome and function as regulatory non-coding RNA in Haloferax volcanii. Archaea 2012, 260909, doi:10.1155/2012/260909 (2012).
5. Sobala, A. & Hutvagner, G. Small RNAs derived from the 5' end of tRNA can inhibit protein translation in human cells. RNA Biol 10, 553-563, doi:10.4161/rna.24285 (2013).
6. Saikia, M. et al. Angiogenin-cleaved tRNA halves interact with cytochrome c, protecting cells from apoptosis during osmotic stress. Molecular and cellular biology 34, 2450-2463, doi:10.1128/MCB.00136-14 (2014).
7. Hanada, T. et al. CLP1 links tRNA metabolism to progressive motor-neuron loss. Nature 495, 474-480, doi:10.1038/nature11923 (2013).
8. Chen, Q. et al. Sperm tsRNAs contribute to intergenerational inheritance of an acquired metabolic disorder. Science 351, 397-400, doi:10.1126/science.aad7977 (2016).
9. Sharma, U. et al. Biogenesis and function of tRNA fragments during sperm maturation and fertilization in mammals. Science 351, 391-396, doi:10.1126/science.aad6780 (2016).
10. Venkatesh, T., Suresh, P. S. & Tsutsumi, R. tRFs: miRNAs in disguise. Gene 579, 133-138, doi:10.1016/j.gene.2015.12.058 (2016).
11. Goodarzi, H. et al. Endogenous tRNA-Derived Fragments Suppress Breast Cancer Progression via YBX1 Displacement. Cell 161, 790-802, doi:10.1016/j.cell.2015.02.053 (2015).
12. Emara, M. M. et al. Angiogenin-induced tRNA-derived stress-induced RNAs promote stress-induced stress granule assembly. J Biol Chem 285, 10959-10968, doi:10.1074/jbc.M109.077560 (2010).
13. Olvedy, M. et al. A comprehensive repertoire of tRNA-derived fragments in prostate cancer. Oncotarget, doi:10.18632/oncotarget.8293 (2016).
14. Maute, R. L. et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110, 1404-1409, doi:10.1073/pnas.1206761110 (2013).
15. Lee, Y. S., Shibata, Y., Malhotra, A. & Dutta, A. A novel class of small RNAs: tRNA-derived RNA fragments (tRFs). Genes & development 23, 2639-2649, doi:10.1101/gad.1837609 (2009).
16. Greenway, M. J. et al. ANG mutations segregate with familial and 'sporadic' amyotrophic lateral sclerosis. Nature genetics 38, 411-413, doi:10.1038/ng1742 (2006).
17. van Es, M. A. et al. Angiogenin variants in Parkinson disease and amyotrophic lateral sclerosis. Annals of neurology 70, 964-973, doi:10.1002/ana.22611 (2011).
18. Selitsky, S. R. et al. Small tRNA-derived RNAs are increased and more abundant than microRNAs in chronic hepatitis B and C. Scientific reports 5, 7675, doi:10.1038/srep07675 (2015).
19. Blanco, S. et al. Aberrant methylation of tRNAs links cellular stress to neuro-developmental disorders. The EMBO journal 33, 2020-2039, doi:10.15252/embj.201489282 (2014).
20. Telonis, A. G. et al. Dissecting tRNA-derived fragment complexities using personalized transcriptomes reveals novel fragment classes and unexpected dependencies. Oncotarget 6, 24797-24822, doi:10.18632/oncotarget.4695 (2015).
21. Dhahbi, J. M. et al. 5' tRNA halves are present as abundant complexes in serum, concentrated in blood cells, and modulated by aging and calorie restriction. BMC genomics 14, 298, doi:10.1186/1471-2164-14-298 (2013).
22. Schageman, J. et al. The complete exosome workflow solution: from isolation to characterization of RNA cargo. BioMed research international 2013, 253957, doi:10.1155/2013/253957 (2013).