應用實例 | 顯微成像技術在干細胞研究中的應用

干細胞涉及到個體發(fā)育、器官移植、延緩衰老、癌癥治療等方方面面。單個的干細胞是如何分裂、分化成新的細胞、組織或器官呢？在成體中，干細胞又是如何完成細胞修復更新的使命呢？在下面的文章中，我們將介紹如何借助共聚焦、雙光子等顯微成像分析技術一一解決在干細胞研究中的這些問題。

激光共聚焦掃描顯微鏡可以精確可控的進行的光學切片，清晰呈現(xiàn)細胞每一層的亞結構信息，這對研究研究蛋白定位、細胞器分化等非常重要。如需研究氯胺酮(Ketamine)對iPSC誘導的神經(jīng)元線粒體形態(tài)的影響，即可采用共聚焦呈現(xiàn)清晰圖像。

圖1 氯胺酮(Ketamine)對iPSC誘導的神經(jīng)元線粒體形態(tài)的影響。

（Ketamine Causes Mitochondrial Dysfunction in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived NeuronsHiroyuki Ito, Tokujiro Uchida, Koshi Makita. PLoS One. 2015; 10(5): 2015 May 28. doi: 10.1371/journal.pone.0128445）

這種藥物刺激實驗，往往需要在活細胞中加入藥物并實時跟蹤。那么如何保持細胞的活性呢？很簡單，只需要將細胞培養(yǎng)環(huán)境重現(xiàn)在顯微鏡上即可，可稱之為Live on the Stage。目前徠卡LAS X軟件系統(tǒng)提供從采集拍攝到分析一站式服務，而且還可以是在線控制細胞生長的溫度、濕度、CO2等各種環(huán)境條件。下圖是常見的大箱式培養(yǎng)裝置及小型細胞培養(yǎng)箱：

圖 2 顯微鏡上常用的培養(yǎng)裝置。（左圖：大箱式培養(yǎng)裝置，整個顯微鏡環(huán)境更穩(wěn)定；右圖：小型培養(yǎng)裝置，便于操作）

有些細胞形態(tài)甚至命運的變化需要很長時間才能體現(xiàn)出來，那么長時間培養(yǎng)拍攝過程中焦面的穩(wěn)定尤為重要。德國品質(zhì)保證了徠卡顯微鏡本身超強的穩(wěn)定性，同時徠卡還提供AFC（Adaptive Focus Control，自動焦面控制系統(tǒng)）實時追蹤穩(wěn)定細胞培養(yǎng)皿底與物鏡之間的物鏡距離，硬件上保證焦面的穩(wěn)定；但是由于細胞生長自身引起的焦面變化怎么辦呢？徠卡軟件Best Focus，提供五種算法，無論明場還是熒光成像，均可實時最終目標細胞。有了這些硬件、軟件焦面穩(wěn)定保障，再也不用擔心細胞不見了。

干細胞研究中常常設計多個基因或多種刺激條件，很顯然每次只對一個樣品成像不僅效率低下而且實驗重復性差。此時即可采用徠卡的多點掃描成像（Mark and Find，適用于每個點成像要求一致，樣品點不是很多）或高內(nèi)涵成像（HCS，適用于多點、多孔板、負責實驗）。如下圖所示，HCS不僅可以對多孔板的多個孔自動成像，還可以對不同孔采用不同的成像條件，滿足各種復雜實驗需求。

圖3 HCS高內(nèi)涵成像。

干細胞成像研究后期均要進入體內(nèi)研究，目前已有多重方法追蹤單個干細胞的最終分化命運，如常見的R26R-Confetti 轉(zhuǎn)基因策略。這種方法涉及到CFP、GFP、YFP及RFP四種熒光蛋白的表達， 而這四種熒光蛋白的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（圖5，左圖）非常接近，特別是GFP和YFP，非常容易串色，對共聚焦顯微鏡提出了苛刻的要求。徠卡采用專利的棱鏡分光，狹縫檢測系統(tǒng)，可自由調(diào)節(jié)檢測器對熒光信號的接收范圍，最大效率收集熒光信號，避免串色；同時，在分光鏡上突破傳統(tǒng)的二向色鏡，不在受限于濾鏡鍍膜限制，采用完全自由的AOBS系統(tǒng)（圖5， 右圖），配合光譜式檢測器，完全實現(xiàn)自由檢測，最大程度上避免熒光串色，直接得出實驗結果，而無需再采用軟件串色分離等后期圖像處理。

圖4 R26R-Confetti 轉(zhuǎn)基因原理及應用。

上圖：R26R-Confetti 轉(zhuǎn)基因原理：編碼四種熒光蛋白的Brainbow2.1被插入到的Rosa26位點處，Cre激活后，neomycin被剪切掉，四種熒光蛋白隨機表達在不同的細胞中且在細胞中的定位有所不同，GFP核定位，CFP特異性表達在細胞膜，另外兩種則是胞質(zhì)定位。

下圖：多種組織中利用R26R-Confetti追蹤干細胞命運。標尺: 50 um; Pancreas/Kidney/Liver中標尺為100 um。

（Cell. 2010 Oct 1;143(1):134-44. doi: 10.1016/j.cell.2010.09.016.

Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Snippert HJ1, van der Flier LG, Sato T, van Es JH, van den Born M, Kroon-Veenboer C, Barker N, Klein AM, van Rheenen J, Simons BD, Clevers H.）

圖5 CFP、GFP、YFP及RFP四種熒光蛋白的激發(fā)和發(fā)射光譜及AOBS系統(tǒng)。

干細胞生長的微環(huán)境對于干細胞的功能、命運至關重要，無論是體外模擬干細胞生長的3D環(huán)境還是直接觀察體內(nèi)的干細胞，在成像時均需要較高的穿透深度和靈敏度，此時多光子顯微鏡因為具有更高的穿透性、更低的光毒性，比常規(guī)共聚焦顯微鏡有更大的優(yōu)勢。結合高精度載物臺及軟件記憶功能，可實現(xiàn)在體（In vivo）干細胞分裂、分化的長時間跟蹤。如在跟蹤小腸隱窩單細胞命運的實驗中，不能把實驗小鼠放在顯微鏡載物臺上連續(xù)培養(yǎng)拍攝跟蹤，那么如何跟蹤單個細胞的命運？如何能在下一個實驗時間點準確的找到原來的拍攝位置呢？其實可以借助顯微鏡上配的高精度電動載物臺及軟件的記憶功能，以小鼠的血管等有顯著結構的部位作為參考點，順利在每次拍照中找到原來的拍攝視野（圖 6）。這樣不僅可以利用雙光子顯微鏡重現(xiàn)整個隱窩中干細胞的三維立體分布

還可以將多天長時間拍攝的圖片連接起來還原單個干細胞的命運。

圖6 追蹤還原體內(nèi)成像的拍攝視野。a）成像視野的相對坐標可以被軟件記錄并存儲調(diào)用；b)小鼠的血管結構可以用做參考點；c)  成像視野被找到并拍攝，標尺20 um。

(Nature. 2014 Mar 20;507(7492):362-5. doi: 10.1038/nature12972. Epub 2014 Feb 16.)

顯微成像技術使得干細胞的分化、發(fā)育等過程變得實時可見。本文中囿于篇幅限制沒有提及的超高分辨率顯微成像技術更能在納米水平清晰揭示干細胞中亞結構的變化，相信能為干細胞研究提供另一把利器。