數(shù)據(jù)非依賴采集DIA 解決方案

隨著生命科學(xué)的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)的關(guān)注焦點(diǎn)和研究趨勢(shì)已經(jīng)逐漸從定性轉(zhuǎn)向定量。定量蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)細(xì)胞、組織乃至完整生物體的蛋白質(zhì)表達(dá)量及差異進(jìn)行分析，對(duì)于生物過(guò)程機(jī)理的探索和臨床診斷標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證具有重要意義。

 

基于靜電場(chǎng)軌道阱 Orbitrap 的數(shù)據(jù)非依賴采集（Data Independent Acquisition, DIA）是賽默飛為用戶帶來(lái)的一項(xiàng)全新的、全息式的質(zhì)譜技術(shù)。DIA 將質(zhì)譜整個(gè)全掃描范圍分為若干個(gè)窗口，高速、循環(huán)地對(duì)每個(gè)窗口中的所有離子進(jìn)行選擇、碎裂、檢測(cè)，從而無(wú)遺漏、無(wú)差異地獲得樣本中所有離子的全部碎片信息（圖 1）。

 

 

圖 1. DIA 與經(jīng)典 Shotgun、SRM/MRM 的原理比較

 

與傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)“鳥(niǎo)槍法”（Shotgun）相比，DIA：(1) 無(wú)歧視地獲得所有肽段的信息，不會(huì)造成低豐度蛋白信息的丟失，(2)循環(huán)時(shí)間固定，掃描點(diǎn)數(shù)均勻，定量準(zhǔn)確度高，(3) 肽段的選擇沒(méi)有隨機(jī)性，數(shù)據(jù)可以回溯，對(duì)于復(fù)雜蛋白樣本，特別是低豐度蛋白具有更優(yōu)異的重現(xiàn)性。與傳統(tǒng)質(zhì)譜定量“金標(biāo)準(zhǔn)”選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)/ 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM/MRM）相比，DIA：(1) 無(wú)需提前指定目標(biāo)肽段，適用于未知蛋白分析；(2) 無(wú)需優(yōu)化方法，獲得數(shù)據(jù)后再基于譜圖庫(kù)實(shí)現(xiàn)定性確證和定量離子篩選；(3) 通量無(wú)上限，適合大規(guī)模蛋白定量分析。

 

形象地說(shuō)，Shotgun 就像機(jī)槍掃射，高效率地打擊盡可能多的目標(biāo)；SRM/MRM 就像精準(zhǔn)狙擊，準(zhǔn)確無(wú)誤地打擊特定目標(biāo)；而DIA 就像地毯式轟炸，無(wú)遺漏地打擊全部目標(biāo)（圖 2）。

 

 

圖 2. Shotgun、DIA 和 SRM/MRM 的特點(diǎn)比較

 

DIA 有效結(jié)合了 Shotgun 和 SRM/MRM 的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，為用戶帶來(lái)全新的質(zhì)譜分析體驗(yàn)，和強(qiáng)大的蛋白質(zhì)組學(xué)定量策略。在臨床研究中，高度的復(fù)雜性、龐大的樣本量、樣本的不穩(wěn)定性是分析的難點(diǎn)，而 DIA 提供條件統(tǒng)一、無(wú)差別的質(zhì)譜采集方法，能夠在樣本信息“完全未知”的情況下，對(duì)樣本進(jìn)行高通量、高速度采集，獲得數(shù)據(jù)之后再進(jìn)行深入解析和挖掘，是臨床蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)的利器。在生物學(xué)研究中，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)或多種條件下蛋白表達(dá)量的變化趨勢(shì)是分析的重點(diǎn)，而 DIA 的靈敏度、精確度和重現(xiàn)性為獲得準(zhǔn)確、可靠的定量結(jié)果提供了有力保障。

 

DIA 通常將 m/z 400–1200 的全掃描范圍分割為 25 m/z 的窗口（共 32 個(gè)窗口），依次（m/z 400-425、m/z 425-450、……、m/z 1175-1200）將窗口內(nèi)所有的離子選擇、碎裂，并檢測(cè)該窗口內(nèi)離子產(chǎn)生的所有碎片，一次循環(huán)獲得 32 張二級(jí)譜圖，并不斷循環(huán)往復(fù)地進(jìn)行采集（圖 3）。

 

圖 3. DIA 采集原理

 

Orbitrap 所具有的超高分辨率（_ 140,000）、超快掃描速度（32–64 ms）、超高靈敏度（amol 級(jí)），使 DIA 相比目前其他類(lèi)似技術(shù)，如 SWATH 等，能夠?yàn)橛脩魩��?lái)更出色的性能體驗(yàn)。此外，Orbitrap 靈活多樣的采集方式，還能為用戶帶來(lái)更靈活的方法設(shè)置：(1)根據(jù)樣本的復(fù)雜程度使用更窄的選擇窗口（如 20 m/z ）或不對(duì)稱窗口（在出峰密集的范圍使用更窄的選擇窗口），實(shí)現(xiàn)更好的選擇性；(2) 根據(jù)肽段的信號(hào)強(qiáng)度調(diào)整離子注入時(shí)間及分辨率，達(dá)到更高的靈敏度；(3) 針對(duì)大規(guī)模樣本使用更快的掃描速度和更短的梯度，進(jìn)一步提高分析效率；(4) 加入一級(jí)全掃描，采集碎片的同時(shí)獲得母離子信息，實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的定性定量。

 

Orbitrap 超高分辨質(zhì)譜除了為用戶帶來(lái)超高分辨率、超快掃描速度和超高靈敏度的分析性能外，先進(jìn)的設(shè)計(jì)理念使其具有其他任何質(zhì)譜都無(wú)法實(shí)現(xiàn)的功能——多重累積技術(shù)（Multiplexing, msx）。將多重累積技術(shù)與 DIA 相結(jié)合，形成獨(dú)一無(wú)二的 msxDIA，進(jìn)一步縮小 DIA 的選擇窗口，提高 DIA 的選擇性。

 

msxDIA 隨機(jī)將 5 個(gè) 4 m/z 窗口（或 2 個(gè) 10 m/z 窗口）依次選擇、碎片、并累積在一起，最后同時(shí)注入 Orbitrap 進(jìn)行掃描，獲得5 個(gè) 4 m/z 窗口（或 2 個(gè) 10 m/z 窗口）中全部碎片信息的譜圖，再隨機(jī)選擇另外 5 個(gè) 4 m/z 窗口（或 2 個(gè)10 m/z 窗口）分析并依次進(jìn)行下去，直至覆蓋整個(gè)全掃描范圍。msxDIA 總步長(zhǎng)為 20 m/z ，不影響掃描速度，而這 20 m/z 由 5 段（或 2 段）獨(dú)立的窗口組成，客觀上使選擇窗口縮小到僅 4 m/z （或 10 m/z 窗口）。圖 4 以 2 x 10 m/z 模式為例，展示了 msxDIA 的原理。

 

圖 4. msxDIA 采集原理（2 x 10 m/z 模式）

 

msxDIA 采集得到的數(shù)據(jù)再利用 Skyline 軟件去多重累積（de-multiplexing），即可將每個(gè)碎片及響應(yīng)強(qiáng)度歸屬到特定窗口，實(shí)現(xiàn)與 Shotgun、SRM/MRM 相當(dāng)?shù)倪x擇性，最大程度地減少共流出肽段和雜質(zhì)的干擾（圖 5）。msxDIA 是 Orbitrap 獨(dú)一無(wú)二的全新掃描技術(shù)，其成果最先由 Skyline 的開(kāi)發(fā)者、華盛頓大學(xué) MacCoss 教授團(tuán)隊(duì)提出，并發(fā)表在《Nature Method》雜志上（Nat. Methods, 2013, 10(8): 744-746）。

 

圖 5. msxDIA 去多重累積前后比較

 

 

• 采集所有離子及碎片譜圖，不丟失任何信息，重現(xiàn)性好；

• 數(shù)據(jù)易于追溯，即使目前的水平無(wú)法發(fā)現(xiàn)某些蛋白/ 化合物，未來(lái)可以回溯；

• 無(wú)需優(yōu)化方法，對(duì)于易降解樣品可以即刻采集，獲得數(shù)據(jù)后再深入挖掘；

• 基于碎片離子（即母子離子對(duì)）定量，選擇性好，與 SRM/MRM 相當(dāng)；

• 循環(huán)時(shí)間固定，掃描點(diǎn)數(shù)均勻，定量準(zhǔn)確度高；

• 通量無(wú)上限，同時(shí)監(jiān)測(cè)所有目標(biāo)蛋白/ 化合物；

• 相同肽段不同翻譯后修飾位點(diǎn)的定量區(qū)分與辨別。

 

• 通常 35,000–60,000 分辨率采集，對(duì)復(fù)雜樣品定性定量準(zhǔn)確度高；

◆ Q-TOF DIA* 采集分辨率為 20,000 左右

• 質(zhì)量軸長(zhǎng)期穩(wěn)定地保持在 1 ppm，無(wú)需內(nèi)標(biāo)校正或頻繁外標(biāo)校正，數(shù)據(jù)更放心、通量更高；

◆ Q-TOF DIA* 采集需內(nèi)標(biāo)校正或頻繁外標(biāo)校正

• Amol（10-18 mol）級(jí)的超高靈敏度，譜圖質(zhì)量高；

◆ Q-TOF DIA* 采集靈敏度低

• 12–20 Hz 的超快掃描速度，同時(shí)保持 amol 級(jí)的超高靈敏度；

◆ Q-TOF DIA* 采集提高掃描速度則丟失靈敏度

• 動(dòng)態(tài)范圍及線性范圍達(dá) 5 個(gè)數(shù)量級(jí)以上；

◆ Q-TOF DIA* 采集動(dòng)態(tài)范圍在 3~4 個(gè)數(shù)量級(jí)

• 獨(dú)一無(wú)二的多重累積 msxDIA，進(jìn)一步提高選擇性；

◆ Q-TOF DIA* 無(wú)此功能

• 靈活多樣的掃描功能，實(shí)現(xiàn) pSMART、WiSIM 等諸多獨(dú)特 DIA 模式。

◆ Q-TOF DIA* 掃描模式單一

 

*: 此處 DIA 指 Ruedi Aebersold 發(fā)展的“Sequential Window Acquisition Trough High-resolution”技術(shù)（Mol. Cell. Proteomics, 2012, 11(6): O111.016717）

 

 

Thermo Fisher Scientific 建立的專(zhuān)門(mén)針對(duì)基于 Orbitrap 的數(shù)據(jù)非依賴采集（DIA）解決方案，工作流程（圖 6）統(tǒng)一、方法成熟、簡(jiǎn)單易用，適用于任何復(fù)雜生物學(xué)樣本和臨床樣本的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析。

 

基于 Orbitrap 的 DIA 解決方案分為三步：首先，樣本前處理與經(jīng)典的 Shotgun 流程完全一致，樣本經(jīng)蛋白提取、酶解、除鹽，再根據(jù)需要經(jīng)過(guò)特定的分離富集、純化后，即可直接進(jìn)樣分析，或加入混合標(biāo)肽后再進(jìn)樣分析（保留時(shí)間校正）；然后，無(wú)需事先了解樣本信息，直接使用統(tǒng)一的 DIA 模板，即可快速、高通量地進(jìn)行 Orbitrap 質(zhì)譜采集，獲得高質(zhì)量 DIA 數(shù)據(jù)；最后，DIA 數(shù)據(jù)使用權(quán)威 Skyline 軟件與譜圖庫(kù)匹配打分，獲得可信的鑒定結(jié)果，并自動(dòng)挑選響應(yīng)最高、選擇性最好的若干子離子，進(jìn)行離子對(duì)色譜峰提取，即可獲得準(zhǔn)確的定量信息。

 

 

圖 6. 基于 Orbitrap 的數(shù)據(jù)非依賴采集（DIA）解決方案

 

 

基于傅里葉變換原理的靜電場(chǎng)軌道阱 Orbitrap 是 30 年來(lái)唯一基于全新理論的質(zhì)量分析器，集超高分辨率、超高質(zhì)量精度、超高靈敏度等卓越性能于一體，還具有質(zhì)量軸極其穩(wěn)定、操作維護(hù)簡(jiǎn)單、使用成本低廉等優(yōu)勢(shì)。從 2005 年第一臺(tái)商品化的 Orbitrap 質(zhì)譜上市以來(lái)，極大地推動(dòng)了以蛋白質(zhì)組學(xué)為代表的高水平科學(xué)研究的發(fā)展，迅速成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的唯一金標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，近年來(lái)，使用 Orbitrap 在 Nature、Science、Cell 等高水平期刊上發(fā)表論文的數(shù)量，是使用所有其他高分辨質(zhì)譜發(fā)表論文數(shù)量總和的三倍，成為前沿科學(xué)研究的利器（圖 7）。

 

 

圖 7. Orbitrap 結(jié)構(gòu)圖及發(fā)表高水平論文趨勢(shì)比較

 

 

圖 8. 定量分析的利器——Q Exactive 系列超高分辨 Orbitrap 質(zhì)譜儀

 

 

Q Exactive 的 DIA 方法編輯簡(jiǎn)單、易上手，流程一目了然，無(wú)需任何 DIA 分析經(jīng)驗(yàn)。僅三步，即可完成全部方法設(shè)置（圖 9）：(1)在模板中將 DIA 模塊拖入方法流程（若加入一級(jí)掃描，則在 DIA 模塊前拖入 Full Mass 模塊）；(2) 根據(jù)需要修改 DIA 模塊中的分辨率（通常設(shè) 35000）和窗口寬度（若實(shí)際窗口步長(zhǎng)為 25 m/z ，則設(shè) 26 m/z ，多 1 m/z 為窗口之間 Overlap）；(3) Inclusion List中生成每個(gè)窗口的中間值（m/z ）作為 target。三步完成后保存方法，即刻開(kāi)始樣品數(shù)據(jù)采集。

 

圖 9. 三步完成 DIA 方法編輯

 

典型 DIA 數(shù)據(jù)如圖 10 所示，從色譜圖上看 DIA 數(shù)據(jù)與傳統(tǒng) Shotgun 數(shù)據(jù)沒(méi)有明顯區(qū)別，只是每個(gè)循環(huán)的二級(jí)譜圖數(shù)量固定，因此掃描點(diǎn)分布均勻。

 

圖 10. 典型的 DIA 數(shù)據(jù)

 

圖 11. 四步完成 msxDIA 方法編輯

 

Orbitrap 具有的獨(dú)一無(wú)二的 msxDIA 方法設(shè)置同樣簡(jiǎn)單易用，只多一步隨機(jī) Inclusion list 生成（圖 11）： (1) 在模板中將 DIA 模塊拖入方法流程（若加入一級(jí)掃描，則在 DIA 模塊前拖入 Full Mass 模塊）；(2) 以 2 x 10 m/z 為例，DIA 模塊中的 MSX count 設(shè)為 2，窗口寬度設(shè)為 10 m/z ，即完成 2 x 10 m/z 模式參數(shù)設(shè)置；(3) 使用 Skyline 軟件生成隨機(jī)的 Inclusion list 表；(4) 將隨機(jī) Inclusion list 表導(dǎo)入方法的 Inclusion list 中，完成方法設(shè)置，即刻可以開(kāi)始 msxDIA 數(shù)據(jù)采集。

 

典型 msxDIA 二級(jí)質(zhì)譜圖如圖 12 所示，每張譜圖包含 2 個(gè)（2 x 10 m/z 模式）或 5 個(gè)（5 x 4 m/z 模式）窗口的碎片信息，即一次掃描采集 2 個(gè)或 5 個(gè)窗口，分析效率顯著提高，選擇性也因窗口縮小而明顯改善。

 

圖 12. 典型的 msxDIA 二級(jí)質(zhì)譜圖

 

DIA/SWATH 數(shù)據(jù)復(fù)雜、信息量龐大，因此，高效、可靠的數(shù)據(jù)解析和信息挖掘是 DIA/SWATH 分析的瓶頸。

 

Skyline 軟件是華盛頓大學(xué) MacCoss 教授實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的目標(biāo)蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件（https://skyline.gs.washington.edu），是 DIA/SWATH 數(shù)據(jù)處理的權(quán)威工具，由于功能全面、性能強(qiáng)大而受到普遍認(rèn)可，是目前使用最廣泛的 DIA/SWATH 解析軟件。通過(guò)與Thermo Fisher Scientific 的緊密合作，MacCoss 教授實(shí)驗(yàn)室有針對(duì)性地優(yōu)化了 Skyline 對(duì) Orbitrap 數(shù)據(jù)的處理，一步實(shí)現(xiàn)從原始數(shù)據(jù)到最終結(jié)果的完整 DIA 解析流程，使 Orbitrap DIA 如虎添翼。

 

以 Proteome Discoverer 軟件（或 MaxQuant、Mascot 等）搜庫(kù)鑒定結(jié)果為譜圖庫(kù)，導(dǎo)入 Skyline 軟件；設(shè)置肽段、離子對(duì)挑選規(guī)則；將符合條件的肽段及子離子從譜圖中挑選出來(lái)，生成 Target List；導(dǎo)入 DIA/msxDIA 數(shù)據(jù)，根據(jù) Target List 提取離子對(duì)色譜峰，進(jìn)行子離子匹配和峰面積計(jì)算，實(shí)現(xiàn)對(duì)肽段的同時(shí)定性和定量（圖 13）。若樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)肽段，則可利用標(biāo)準(zhǔn)肽段進(jìn)行保留時(shí)間校正。

 

圖 13. Skyline 處理 DIA 數(shù)據(jù)完整流程

 

圖 14. 使用 mProphet 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并卡值過(guò)濾

 

使用 Skyline 內(nèi)嵌的 mProphet 卡值工具對(duì)譜圖匹配結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，綜合考慮 dotp 分?jǐn)?shù)、信號(hào)響應(yīng)、保留時(shí)間、質(zhì)量偏差等因素計(jì)算 q 值，過(guò)濾結(jié)果，獲得高度可信的肽段定性結(jié)果（q < 0.01）（圖 14）。

 

經(jīng)定性卡值（q < 0.01）后，最終獲得所有可靠離子對(duì)的色譜峰面積和 CV 值，將結(jié)果以 Excel 表格式導(dǎo)出，使用 CV < 20% 的離子對(duì)峰面積進(jìn)行定量分析，完成 DIA 分析工作（圖 15）。

 

圖 15. 獲得離子對(duì)峰面積、CV 值，計(jì)算定量結(jié)果

 

該應(yīng)用實(shí)例為采用 DIA 方法完成的大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)及磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)定量實(shí)驗(yàn)。在 120 分鐘的有效梯度內(nèi)，以 q < 0.01 和CV < 20% 為過(guò)濾條件，在 200 ng Hela 全細(xì)胞裂解液中同時(shí)定量 3597 個(gè)高可信度蛋白質(zhì)（21710 肽段）；并在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，同時(shí)定量了 11341 條高可信度的大鼠磷酸化肽段。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，無(wú)論是常規(guī)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)還是翻譯后修飾定量研究，DIA 方法都具有無(wú)可比擬的定量性能。

 

 

 

 

 

Q Exactive 系列 Orbitrap 超高分辨質(zhì)譜儀

（Q Exactive、Q Exactive Plus 和 Q Exactive HF）

 

UltiMate ™ 3000 RSLCnano 納升超高效液相色譜儀

 

Orbitrap Fusion“三合一”系列 Orbitrap 超高分辨質(zhì)譜儀

 

Easy-nLC 納升超高效液相色譜儀

Pierce ™ Peptide Retention Time Calibration Mixture 標(biāo)準(zhǔn)肽段混合物（Catalog No. 88320 & 88321）

 

Proteome Discoverer 蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件

（http://portal.thermo-brims.com/）

 

Skylines 數(shù)據(jù)非依賴采集分析軟件

（免費(fèi)，https://skyline.gs.washington.edu）

 

更多 DIA 相關(guān)信息資源：

• 請(qǐng)?jiān)L問(wèn) Orbitrap 官方信息網(wǎng)站：

Planet Orbitrap (http://planetorbitrap.com/)

 

 

• 請(qǐng)關(guān)注 Orbitrap 蛋白質(zhì)組學(xué)微信公眾號(hào)：

Orbitrap 組學(xué)俱樂(lè)部（MSOmics）