脾臟、胸腺和淋巴結中單個核細胞分離和培養(yǎng)

基本方案

從小鼠脾臟、胸腺和淋巴結制備單個核細胞分離和培養(yǎng)。

實驗材料
1.RPMI-5或DMEM-5完全培養(yǎng)基。
2.新鮮分離的小鼠器官：≤6周齡的小鼠胸腺；6周至6個月齡的小鼠脾臟和淋巴結。
3.60mm×15mm培養(yǎng)皿。
4.剪刀和鑷子（保存在70%乙醇的燒杯中）。
5.裝有19G針頭的6ml注射器。
6.200μm尼龍濾網(wǎng)。
 
實驗方法
1.將新鮮分離的器官放入盛有3ml RPMI-5或DMEM-5完全培養(yǎng)基的60mm×15mm培養(yǎng)皿（每種器官一個培養(yǎng)皿）中，用剪刀將器官剪碎。
2.用6ml注射器的活塞將組織塊向培養(yǎng)皿底面用力擠壓直至僅剩纖維組織。
3.用裝有19G針頭的6ml注射器將組織懸液反復抽吸數(shù)次，以進一步粉碎組織團塊。
4.將細胞懸液通過200μm尼龍濾網(wǎng)濾入離心管中。用約4ml完全培養(yǎng)基洗一次培養(yǎng)皿，如需要則重復一次，之后將洗液通過濾網(wǎng)加入離心管中。
5.在Sorvall H-1000B離心機中以1000r/min（200g）離心10min后棄上清（如需要去除紅細胞和死細胞，見輔助方案）。用20ml完全培養(yǎng)基將沉淀重懸后離心，再以適量培養(yǎng)基重懸以便計數(shù)。
6.如細胞不能立即處理，最好的保存細胞活力的方法是將細胞懸液置于冰塊中。這種處理也能減少因細胞貼壁引起的細胞損失。
 
附錄：
RPMI-5完全培養(yǎng)基：
RPMI1640培養(yǎng)基（Life Technologies）
5%FBS, 56℃熱滅活1h
10mmol/L HEPES
20μg/ml 硫酸慶大霉素
50μmol/L 2-ME
過濾除菌

PriCells提供產(chǎn)品
1. 各種原代細胞特制基礎培養(yǎng)基；
2. 各種原代細胞培養(yǎng)特制添加劑；
3. 原代細胞分離試劑盒；
4. 原代細胞鑒定試劑盒；
5. 原代細胞轉(zhuǎn)染試劑盒；
6. 原代細胞總蛋白質(zhì)抽提物；
7. 原代細胞總RNA；
8. 原代細胞總DNA；