NCI-H358的細(xì)胞培養(yǎng)與基因編輯步驟及注意事項(xiàng)

NCI-H358是一種人類非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞系，當(dāng)前廣泛應(yīng)用于KRAS基因突變相關(guān)的研究中。KRAS G12C突變在NSCLC中較為常見，而NCI-H358細(xì)胞系含有KRAS G12C突變，該突變對藥物篩選具有重要影響，因?yàn)樗�直接關(guān)聯(lián)到腫瘤細(xì)胞的信號傳導(dǎo)和細(xì)胞增殖。攜帶KRAS G12C突變的腫瘤細(xì)胞可能對特定的KRAS抑制劑表現(xiàn)出敏感性。例如，Sotorasib（AMG 510）是一種靶向KRAS G12C突變的共價(jià)抑制劑，它通過與KRAS G12C突變蛋白的半胱氨酸12位點(diǎn)形成共價(jià)鍵，從而抑制其活性，影響下游信號傳導(dǎo)。

對于NCI-H358細(xì)胞系，研究人員可以利用其KRAS G12C突變的特性來測試針對這一特定突變的抑制劑，以及其他可能的聯(lián)合用藥策略。此外，NCI-H358細(xì)胞系也被用于研究KRAS G12C突變對腫瘤免疫微環(huán)境的影響，以及探索免疫檢查點(diǎn)抑制劑與KRAS G12C抑制劑的聯(lián)合治療效果。

NCI-H358細(xì)胞小卡片
細(xì)胞名稱：NCI-H358（人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞）
貨號：中科院 TCHu151
生長特性：上皮樣形態(tài)，貼壁生長
培養(yǎng)條件：1640+10%FBS
培養(yǎng)環(huán)境：95%空氣+5%二氧化碳；37℃

NCI-H358應(yīng)用方向

• 藥物篩選

NCI-H358細(xì)胞對多種抗癌藥物表現(xiàn)出敏感性，使其成為評估新藥效果的理想模型。

• 基因功能研究

通過基因敲除或過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，研究特定基因在肺癌發(fā)展中的作用。

• 信號通路分析

研究細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，特別是與KRAS相關(guān)的信號通路。

• 腫瘤微環(huán)境模擬

研究腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞如免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞的相互作用。

NCI-H358細(xì)胞培養(yǎng)
在實(shí)際培養(yǎng)過程中NCI-H358細(xì)胞可以通過改善培養(yǎng)條件來加快增殖速度，當(dāng)細(xì)胞量較多時(shí)，需要注意及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基或傳代。

細(xì)胞培養(yǎng)步驟
細(xì)胞復(fù)蘇
● 取6mL完全培養(yǎng)基于離心管中開始復(fù)蘇；
● 水浴鍋融化至米粒大小冰塊，終止水�。�
● 轉(zhuǎn)移至離心管中離心；
● 重懸細(xì)胞后接種于合適大小的培養(yǎng)皿中；
● 24h后觀察細(xì)胞貼壁情況并換液一次。

細(xì)胞傳代
● 吸棄上清，常溫PBS潤洗一遍；
● 加入胰酶，使胰酶鋪勻皿底；
● 消化到拍打皿時(shí)有部分細(xì)胞脫落，終止消化；
● 吹勻細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至離心管離心；
● 重懸細(xì)胞，按比例接種。

細(xì)胞凍存
● 消化、離心，獲得細(xì)胞沉淀；
● 加入凍存液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至凍存管中；
● 凍存管放入4℃預(yù)冷的程序性凍存盒，再放入-80℃冰箱過夜；
● 第二天轉(zhuǎn)移至液氮保存。

細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)
● 該細(xì)胞對血清質(zhì)量較為敏感，建議使用優(yōu)質(zhì)的胎牛血清或適量增加血清比例；
● 消化時(shí)注意及時(shí)觀察，避免過度消化；
● 細(xì)胞密度越高，培養(yǎng)基消耗越快，注意及時(shí)換液或傳代。

利用Smart-CRISPR™基因編輯NCI-H358細(xì)胞系
基因修飾項(xiàng)目
NCI-H358細(xì)胞系的基因修飾包括基因敲除、點(diǎn)突變、KI、過表達(dá)和干擾等，賽業(yè)生物通過優(yōu)化NCI-H358的培養(yǎng)條件及單克隆制備條件，實(shí)現(xiàn)NCI-H358基因編輯單克隆交付，可顯著提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性，為腫瘤免疫研究提供更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

基因敲除
基于Smart-CRISPR™細(xì)胞基因編輯系統(tǒng)，賽業(yè)生物可提供NCI-H358的KO細(xì)胞定制服務(wù)，交付單克隆純合子。我們使用優(yōu)化的轉(zhuǎn)染體系將RNP直接遞送到細(xì)胞內(nèi)，gRNA切割效率高達(dá)90%以上，相比于質(zhì)粒和病毒等CRISPR/Cas介導(dǎo)的方法，切割效率提升明顯，脫靶效率明顯降低，能更精準(zhǔn)地切割目標(biāo)DNA序列。

點(diǎn)突變
基于Smart-CRISPR™細(xì)胞基因編輯系統(tǒng)我們可提供精準(zhǔn)、高效的NCI-H358定點(diǎn)突變和KI細(xì)胞定制服務(wù)。通過優(yōu)化的α-donor體系將人源化的Cas蛋白、gRNA和donor三組分轉(zhuǎn)染至目的細(xì)胞，產(chǎn)生高效同源重組，HDR高達(dá)49%，實(shí)現(xiàn)單克隆純合子交付。

穩(wěn)轉(zhuǎn)株
賽業(yè)生物優(yōu)化升級了轉(zhuǎn)染載體系統(tǒng)，憑借多年細(xì)胞生物學(xué)經(jīng)驗(yàn)，建立了一套成熟穩(wěn)定的基因過表達(dá)實(shí)驗(yàn)體系，能提供NCI-H358穩(wěn)定表達(dá)外源基因或RNA干擾元件的穩(wěn)定Cell Pool或單克隆細(xì)胞株，可獲得蛋白高表達(dá)10倍以上。

基因編輯注意事項(xiàng)
● 細(xì)胞轉(zhuǎn)染前確保狀態(tài)良好，細(xì)胞密度70%左右；
● 消化時(shí)盡量吹散成單個(gè)細(xì)胞；
● 極限稀釋法制備單克隆，使用賽業(yè)定制條件培養(yǎng)基，并額外添加10%的血清，當(dāng)觀察到有克隆長出后補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。