組織源性正常小鼠原代真皮纖維原細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方法

一、實(shí)驗(yàn)試劑
1、培養(yǎng)基： Primary Cell Medium + 10% FBS + 1% P/S + Primary Cell Supplement
2、凍存液： Primary Cell Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3、洗滌液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S
4、染色液： 0.4% Trypan Blue
5、消化液： Isolation of Primary Cell Kit
6、檢測(cè)試劑：抗小鼠Fibronectin抗體，熒光標(biāo)記二抗，乙醇丙酮混合液（1：1）
 
二、實(shí)驗(yàn)器械
1、培養(yǎng)皿
2、培養(yǎng)瓶
3、直剪和眼科剪
4、眼科鑷
5、玻璃滴管
6、15ml離心管
7、200目網(wǎng)篩
 
三、實(shí)驗(yàn)流程
取材
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取皮片，削成厚度為0.5mm的皮片
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皮片浸泡在75%酒精中消毒
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1 × PBS （pH 7.4 ）清洗皮片兩遍
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皮片剪成（3-5）mm×（10-15）mm大小
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置于消化液中4℃消化過(guò)夜
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剝?nèi)ケ砥�，并刮去真皮下的其他組織
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將組織塊剪成1mm3左右
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加入消化液，37℃消化至消化液渾濁
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停止消化，懸液過(guò)200目網(wǎng)篩
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收集細(xì)胞懸液，800rpm離心5min
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重懸細(xì)胞，重復(fù)離心一次
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重懸細(xì)胞，Trypan Blue染色計(jì)數(shù)，以5×105的數(shù)量接種于培養(yǎng)瓶中
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37℃，5%CO2培養(yǎng)
 
四、實(shí)驗(yàn)操作
1、培養(yǎng)瓶預(yù)包被。試驗(yàn)前一天預(yù)包培養(yǎng)瓶，置于超靜臺(tái)吹干或45℃烘箱烘干（切記保持無(wú)菌），4℃冰箱放置，備用。
 
2、取材：從小鼠身上取皮片，削成厚度為0.5mm左右的皮片；
 
3、材料預(yù)處理：將皮片浸泡在75%的酒精中消毒；用1 × PBS （pH 7.4 ）清洗兩遍（每次約5min）以清除血細(xì)胞；
 
4、初步消化：將皮片剪成（3）mm×（10）mm大小，去除皮下組織；將裁剪好的皮塊置于消化液中4℃消化過(guò)夜；第二天，取出消化好的細(xì)胞，用鑷子盡可能剝?nèi)ケ砥�，并刮去真皮下的其他組織；
 
5、再次消化：處理好后，將組織塊剪成1mm3左右，加入消化液，37℃震蕩消化至消化液渾濁（1h左右）；
 
6、中止消化：中止酶反應(yīng)，懸液過(guò)200目網(wǎng)篩；

7、收集重懸細(xì)胞：收集細(xì)胞懸液，800rpm離心5min；棄上清，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，重復(fù)離心一次；
 
8、細(xì)胞密度計(jì)數(shù)：培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，0.4% Trypan Blue染色計(jì)數(shù)，以5×105的數(shù)量接種于培養(yǎng)瓶中。
 
9、培養(yǎng)：放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。
 
五、細(xì)胞鑒定
1、顯微鑒定：相差顯微鏡下，可見(jiàn)細(xì)胞呈梭形或扁的星狀，具有突起。細(xì)胞具備良好的透光性。
 
2、免疫組織化學(xué)鑒定：利用Fibronectin相關(guān)抗原檢測(cè)。
 
3、細(xì)胞爬片。將洗凈的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板中，接種細(xì)胞為3×104個(gè)/孔，48小時(shí)候細(xì)胞可以長(zhǎng)滿，用鑷子取出鋪滿細(xì)胞的蓋玻片備用。
 
4、細(xì)胞固定：用PBS洗滌細(xì)胞，之后放入乙醇丙酮混合液中，固定10min，空氣中自然干燥。
 
5、特異性抗體：按照說(shuō)明書稀釋比要求稀釋抗體，加入抗體，放置37℃孵育60min。
 
6、洗滌：1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次 × 15 分鐘，晾干。
 
7、標(biāo)記性抗體：加入熒光標(biāo)記抗體，37℃孵育30min。
洗滌：1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次 × 15 分鐘，晾干。
 
8、封片：封片劑封片。
9、鏡檢：熒光顯微鏡下觀察。
 
六、注意事項(xiàng)
1、選材注意時(shí)要將皮膚組織上的被毛去除干凈，也可以使用還未長(zhǎng)出被毛的乳鼠進(jìn)行試驗(yàn)。
 
2、注意盡量將皮片剪成（3）mm×（10）mm大小，如太大則不利于消化，太小則不利于真皮、表皮的物理分離。
 
3、過(guò)度消化損傷嚴(yán)重影響成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此應(yīng)嚴(yán)格掌握好酶的消化濃度和消化時(shí)間。
 
4、嚴(yán)格控制成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)條件。包括細(xì)胞培養(yǎng)用液（培養(yǎng)基，生長(zhǎng)因子，血清，抗生素）的質(zhì)量，濃度。
 
5、關(guān)于培養(yǎng)瓶包被與否，有文獻(xiàn)研究顯示包被與未包被之間沒(méi)有特別大的差異。 實(shí)驗(yàn)中，可以酌情考慮是否包被。
 
6、傳代培養(yǎng)細(xì)胞接種量為5×104個(gè)（25cm2培養(yǎng)瓶），細(xì)胞倍增時(shí)間為48小時(shí)。細(xì)胞傳代培養(yǎng)最佳為8代，傳代次數(shù)增加，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞之間間隙增加，細(xì)胞貼壁牢固，傳代消化時(shí)間會(huì)有所延長(zhǎng)。