組織源性正常大鼠原代心肌細胞培養(yǎng)實驗方法

一、實驗試劑
1、培養(yǎng)基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
2、凍存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3、洗滌液： 1×PBS（pH 7.4）+ 1% P/S
4、染色液： 0.4% Trypan Blue
5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit
6、檢測試劑：一抗小鼠抗大鼠α-橫紋肌肌動蛋白，二抗FITC標記山羊抗小鼠IgG，乙醇丙酮混合液（1∶1）。

二、實驗器械
1、培養(yǎng)皿
2、培養(yǎng)瓶
3、直剪和眼科剪
4、眼科鑷
5、200目網(wǎng)篩
6、玻璃滴管
7、燒杯
8、15ml離心管
 
三、實驗流程
取材
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取心肌組織放入D-Hanks中洗滌3次
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剪碎至1mm3+消化液（PriCells）
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37℃水浴8min，吸棄上層懸液（非心肌細胞）
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余下組織加消化液（PriCells） 37℃磁力攪拌10min，60r/min
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上層懸液加消化終止液（PriCells）
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余下組織再加消化液（PriCells）繼續(xù)消化3-5次
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收集所有混懸液過200目網(wǎng)篩
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收集濾液1000RPM/10min
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去上清，收集沉淀，2ml培養(yǎng)基重懸
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染色計數(shù)

四、實驗操作
1、培養(yǎng)瓶預包被。試驗前一天預包培養(yǎng)瓶，置于超靜臺吹干或45℃烘箱烘干（切記保持無菌），4℃冰箱放置，備用。
 
2、取材：出生1—3天幼鼠。
 
3、材料預處理：將獲取的心臟放入含有1% P/S的1×PBS（pH 7.4）中，剪去心房，反復洗滌，至心室內無血漬，洗滌液澄清為止。
 
4、消化：將心室肌用眼科剪剪成1mm3大小組織塊，加入消化液10ml，37℃水浴8min后，吸取上層混懸液遺棄；余下組織加入消化液10ml，37℃水浴并用磁力攪拌器攪拌10min；吸取上層混懸液，終止反應；剩余沉淀物再加消化液消化3-5次，直至組織塊完全消化。
 
5、終止消化：按1∶1加入消化終止液，中止酶反應。
 
6、收集重懸細胞：收集中止后的消化液于離心管中，1000 rpm，離心10 min，棄去上清，加入培養(yǎng)液重懸，染色計數(shù)細胞。
 
7、培養(yǎng)細胞密度：調整細胞密度以5 × 105個/ml 接種入培養(yǎng)瓶。
 
8、培養(yǎng)：放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。
 
五、細胞鑒定
1、顯微鑒定：接種后12h細胞形態(tài)變?yōu)樗笮位虿灰?guī)則扁平狀，24h后即可看到單個細胞的自發(fā)收縮，繼而細胞逐漸鋪展伸出偽足，形成不規(guī)則的星形，到第3～4天，細胞相互接觸交織成網(wǎng)，形成細胞單層或細胞簇。
 
2、免疫組織化學鑒定：利用α-橫紋肌肌動蛋白抗原檢測。
 
3、細胞爬片。將洗凈的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板中，接種細胞為3×104個/孔，48小時候細胞可以長滿，用鑷子取出鋪滿細胞的蓋玻片備用。
 
4、細胞固定：用PBS洗滌細胞，之后放入乙醇丙酮混合液中，固定10min，空氣中自然干燥。
 
5、特異性抗體：按照說明書稀釋比要求稀釋抗體，加入抗體，放置4℃孵育過夜。
 
6、洗滌：1×PBS（pH 7.4）洗滌3次×15分鐘，晾干。
 
7、標記性抗體：加入熒光標記抗體，37℃孵育1h。
洗滌：1×PBS（pH 7.4）洗滌3次×15分鐘，晾干。
 
8、封片：封片劑封片。
 
9、鏡檢：熒光顯微鏡下觀察，可見胞漿呈棕黃色染色，表明細胞對α-橫紋肌肌動蛋白的表達呈陽性。
 
六、注意事項
1、選用出生1-3d的幼鼠。
 
2、在取出心臟之前給實驗鼠進行消毒處理。
 
3、采用多次消化，直到組織塊完全消化，減少消化液對細胞的損傷。
 
4、由于心肌細胞只占總細胞的25%，在接種心肌細胞之前做差速貼壁，除掉大部分成纖維細胞。
 
5、初分離獲得的心肌細胞在生理濃度的鈣離子溶液中易喪失收縮活性, 為了保持心肌細胞的收縮功能, 在分離的過程中應采用4℃的無鈣離子Hanks＇緩沖液浸泡和沖洗心肌組織。