徠卡課堂 | 徠卡激光顯微切割系統(tǒng)應(yīng)用于腫瘤組織的切片研究

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胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）是第四大癌癥相關(guān)死因的癌癥，診斷后具有5年存活率的病人僅有3%。造成如此之差預(yù)后的原因，主要是因為局部的高復(fù)發(fā)率和對治療的多因素的抵抗。

在胰腺癌中，85%的病人診斷后處在惡性程度很高的階段，主要的特征是浸潤近端的淋巴結(jié)和血管結(jié)構(gòu)，也伴隨轉(zhuǎn)移到肝和腹膜。吉西他濱作為首選藥能夠產(chǎn)生一些臨床效果，但是也僅能起到有限的控制病情，只有小于15%的病人在診斷后6個月中病情不在進(jìn)一步惡化。盡管與其他輔助化學(xué)藥如卡培他濱、厄洛替尼等四藥聯(lián)合治療，也收效甚微。根據(jù)CONKO-001和ESPAC-3的試驗，吉西他濱在佐劑的輔助下也能增加病人的存活率。但是，最有效佐劑的化學(xué)療法尚不清楚。腫瘤切除病人的5年存活率依然徘徊在10%和20%之間。

因此，鑒定在胰腺癌中影響吉西他濱藥效的因子就變得非常重要，這不僅可以最大化治療效果，還可以避免無用的治療手段。在吉西他濱治療的病人當(dāng)中，藥理學(xué)研究表明表達(dá)DNA修復(fù)酶或多肽與核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白之間存在相關(guān)性。然而，在預(yù)后的病人當(dāng)中潛伏的生物標(biāo)志的基因型或表達(dá)水平非常少。

全基因組分析表明，PDAC是由于一些基因突變引起，這些基因通過核心信號通路中的一些小的序列發(fā)揮功能。這不僅可以幫助我們探索發(fā)病機(jī)制，而且提示我們藥物靶向治療的結(jié)點就在基因的表達(dá)調(diào)控之中。

最近，MicroRNA（miRNA）作為一種對基因有負(fù)面調(diào)節(jié)作用的因子對基因調(diào)控有重要作用，它主要是通過壓制或直接裂解mRNA發(fā)揮功能。MicroRNA可以控制增殖、分化和凋亡，一些microRNA基因位點的易位或缺失以及異常的表達(dá)常見于很多腫瘤中，它們可以作為腫瘤壓制基因和癌基因。此外，一些特定的microRNA可能會影響化學(xué)療法的治療。

表達(dá)譜鑒定了4種microRNA在PDAC中有異常，它們是miR-155、miR-21、miR-221、和miR-222。其中miR-21在PDAC中表達(dá)增加。miR-21與卵巢癌的發(fā)生具有相關(guān)性，它還被認(rèn)為在很多實體瘤中起到中樞的作用，比如膠質(zhì)瘤、膽管上皮癌、乳腺癌等。miR-21這種致癌的特性進(jìn)一步的被功能性研究所支持，如果抑制miR-21的表達(dá)，可以減少很多癌細(xì)胞的增殖，如乳腺癌、肝癌和PDAC。相反，如果轉(zhuǎn)染miR-21的前體，就會刺激侵入、滲出和轉(zhuǎn)移，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌以及PDAC。

這些數(shù)據(jù)都提示miR-21可能與癌癥的進(jìn)展有關(guān)，因為它是最容易檢測出的而且也是數(shù)量最多的MicroRNA之一。一些研究把它當(dāng)做預(yù)后的生物標(biāo)志。原位雜交的結(jié)果表明，miR-21的過表達(dá)定位于PDAC細(xì)胞中，預(yù)示著更短的存活率。但是，25位病人的大塊腫瘤組織的PCR結(jié)果顯示，miR-21與臨床病理結(jié)果并無相關(guān)性，與化學(xué)治療也無相關(guān)性。因此，我們進(jìn)一步需要做的是使用激光顯微切割技術(shù)（LMD）排除間質(zhì)的影響，避免樣品的污染。

最近，也有研究報道m(xù)iR-21與抵抗抗癌藥物存在相關(guān)性。尤其是在膽管上皮癌和PDAC中抑制miR-21可以增加癌細(xì)胞對吉西他濱的敏感性。這篇文章主要的目的就是miR-21在PDAC各種類型組織細(xì)胞中的表達(dá)，以及與臨床結(jié)果和吉西他濱藥效之間的關(guān)系。

材料方法

選取了81位PDAC病人，制備冰凍切片，使用LMD獲取組織，精確提取5000個細(xì)胞用于提取RNA，用于后期的qPCR分析，鑒定miR-21的拷貝數(shù)。LMD還提取了5個健康人的胰腺導(dǎo)管。

實驗結(jié)果

從結(jié)果A中我們能夠看到，miR-21在PDAC中比在正常的胰腺導(dǎo)管中有非常高的表達(dá)量。激光切割的樣品較與非切割樣品表達(dá)量也提高很多，這充分說明樣品純化對于結(jié)果準(zhǔn)確的重要性（紅色箭頭所指）。

可以看出，吉西他濱IC50的量隨著miR-21表達(dá)量更加而增加。說明miR-21會抑制吉西他濱的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，造成很差的臨床預(yù)后。

研究結(jié)果表明miR-21與臨床治療結(jié)果以及吉西他濱的藥效具有相關(guān)性。之前研究的PCR結(jié)果并未得到這樣的數(shù)據(jù)，原因在于使用的是整塊的腫瘤組織。因為整塊的腫瘤組織是一個混雜的成分，既有間質(zhì)也有導(dǎo)管，還具有正常的組織，造成了結(jié)果的不準(zhǔn)確性。所以樣品的純度對于我們后期的分析結(jié)果非常的重要。

激光顯微切割技術(shù)

激光顯微切割技術(shù)是一種在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上，通過形態(tài)學(xué)，利用高能的激光束獲取單一細(xì)胞類型樣品的技術(shù)，該技術(shù)成功地解決了大塊分離組織中的細(xì)胞功能異質(zhì)性問題，大大提高了我們分子生物學(xué)后期結(jié)果分析的準(zhǔn)確性。

徠卡作為顯微鏡生產(chǎn)和研發(fā)的世家及領(lǐng)導(dǎo)者，為廣大用戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品。徠卡推出了兩款型號的激光顯微切割系統(tǒng)：LMD6和LMD7。兩款型號的區(qū)別在于所配備的激光器不同。LMD6配備固定頻率的高能激光器，主要適合常規(guī)病理切片和一些相對較薄的植物或其它組織的切片。LMD7配備了一款功率更高、頻率可調(diào)的高能固體激光器，它可以通過調(diào)節(jié)頻率來改變激光的脈沖能量來適合不同樣品。LMD7對樣品的兼容性非常好，適合各種類型的樣品包括組織切片、植物切片、涂片、活細(xì)胞等樣品。

徠卡激光顯微切割的最大特點是采用獨家專利的激光掃描式切割，重力一步法收集。掃描式切割是在切割過程中，高能激光束快速、精準(zhǔn)的切割樣品，區(qū)別于物臺移動方式切割。重力一步法收集是最溫和和最高效的收集方式，完成切割即完成收集，提高實驗速度。

參考文獻(xiàn)

Elisa Giovannetti et al. MicroRNA-21 in Pancreatic Cancer: Correlation with Clinical Outcome and Pharmacologic Aspects Underlying Its Role in the Modulation of Gemcitabine Activity. Cancer Res; 70(11) June 1, 2010