細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)問題及解答(二)

1.液體培養(yǎng)基的保存是冷藏好？還是冷凍好？
要冷藏！因?yàn)橐后w培養(yǎng)基經(jīng)冷凍后再經(jīng)溶化時(shí)，其溶液的PH值會(huì)發(fā)生改變，溶液往往變堿，某些成分溶解也會(huì)受到影響對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利。故液體培養(yǎng)基一定要存放在冷藏箱中，通常液體培養(yǎng)基在冷藏條件下可存放6個(gè)月 ~ 一年。

2.液體培養(yǎng)基中谷氨酰胺的作用，及使用方法。
幾乎所有的細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺有較高的要求，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成蛋白質(zhì)，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)不良而死亡。所以，各種培養(yǎng)液中都含有較大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置-20 ◦C冰凍保存，用前加入培養(yǎng)基中。加有谷氨酰胺的液體培養(yǎng)基4 ◦C 冰箱儲(chǔ)存兩周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來量的谷氨酰胺。

3.培養(yǎng)用液pH對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
由于，大多數(shù)細(xì)胞適宜pH為7.2~7.4，偏離此范圍對(duì)細(xì)胞將產(chǎn)生有害的影響。各種細(xì)胞對(duì)pH的要求也不完全相同，原代培養(yǎng)細(xì)胞一般對(duì)pH變動(dòng)耐受差，無限細(xì)胞系耐受力強(qiáng)。

但總體來說，細(xì)胞耐酸性比耐堿性強(qiáng)一些，偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，我們?cè)谂渲婆囵B(yǎng)用液時(shí)，可把液體的pH稍微調(diào)得偏酸一些。液體在經(jīng)過0.10um或0.22um濾膜過濾時(shí)，溶液的PH還會(huì)向上浮動(dòng)0.2左右。

4.常用培養(yǎng)基及培養(yǎng)用液的滲透壓范圍 
培養(yǎng)基名稱                滲透壓范圍（mOSM） 
DMEM（高糖）                      315 ~ 350 
DMEM（低糖）                       270 ~ 330 
RPMI-1640                      260 ~ 290 
MEM-EBSS                      280 ~ 310 
MEM-NEAA                      280 ~ 310 
McCoy5a                     280 ~ 310 
MEM-a                      280 ~ 310 
M—199                      275 ~ 305 
IMDM                       270 ~ 300 
DMEM/F-12                       280 ~ 310 
F—10                       270 ~ 300 
F—12                       275 ~ 300 

培養(yǎng)基名稱                 滲透壓范圍（mOSM） 
L—15                     280 ~ 320 
D-Hanks                    280 ~ 300 
Hanks                     280 ~ 300

PBS                      275 ~ 300 

5.細(xì)胞傳代消化時(shí)所用胰酶濃度越高越好嗎？
不見得！因?yàn)橐鹊鞍酌溉芤旱南�化能力是和溶液的pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca++, Mg++離子和血清等因素有關(guān)。通常情況下，pH 8.0 , 溫度 37 oC 其作用能力最強(qiáng)。另外，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。我們每次進(jìn)行傳代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反復(fù)沖洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以便于將含血清的培養(yǎng)基沖洗干凈，這樣就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液濃度為：
（1）０.０５％胰蛋白酶＋０.０２％ＥＤＴＡ；
（2）０.２５％胰蛋白酶＋０.０３％ＥＤＴＡ。
（3）0.25% 胰蛋白酶
溶液ｐＨ８.０～９.０；使用Ｄ－Ｈａｎｋ液配制。 
多數(shù)細(xì)胞傳代消化可使用０.０５％胰蛋白酶＋０.０２％ＥＤＴＡ這種消化液。  

6.培養(yǎng)基在使用過程中應(yīng)注意的問題： 
（1） 培養(yǎng)基在使用前需37 oC預(yù)熱或在室溫平衡后再使用。 
（2） 細(xì)胞培養(yǎng)過程中，吸取過培養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼，防止殘留在吸管內(nèi)的培養(yǎng)基焦化，將有害物質(zhì)帶入培養(yǎng)液中。 
（3） 盡量縮短各種液體、細(xì)胞的暴露時(shí)間。 
（4） 避免液體間、細(xì)胞間的交叉污染。 
（5） 配制完全培養(yǎng)基時(shí)，配制的量最好在2周內(nèi)用完為好。

7.血清的有關(guān)問題： 
新生牛血清：新出生牛5天內(nèi)取血制成 
小牛血清：小牛出生16周以內(nèi)采血制成。 
胎牛血清：（進(jìn)口血清）要求剖腹取胎制成。 
國(guó)內(nèi)廠家往往不能做到，經(jīng)常把出生2天以內(nèi)采血稱為胎牛血清。 
根據(jù)血清的生產(chǎn)工藝及血紅蛋白、內(nèi)毒素含量又分為： 
（1）.特級(jí)胎牛血清：40納米過濾，內(nèi)毒素含量≤10EU， 血紅蛋白含量≤10mg/dl。 
（2）.優(yōu)等胎牛血清：經(jīng)過3次100納米過濾，內(nèi)毒素含量≤25EU/ml，血紅蛋白含量≤25mg/ml。
（3）.標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清：3次100納米過濾，低內(nèi)毒素， 低血紅蛋白含量。 
（4）.活性碳/葡聚糖處理血清：激素含量大大降低。 
（5）.透析型胎牛血清：次黃嘌呤和胸腺核苷含量大大降低。 

8. 其他細(xì)胞培養(yǎng)用液：除培養(yǎng)基、血清、谷氨酰胺外，其他幾種液體也屬必須，不可省略。 
（1）雙抗：200倍，（1ml/支）其終濃度為青霉素100U/ml；鏈霉素100ug/ml，-24 oC保存。 
（2）L-谷氨酰胺：100倍，（1ml/支）， 終濃度2mM，-24 oC保存。 
（3）丙酮酸鈉：配制濃度50mM，4ml/支，終濃度為1mM/ml， -24 oC保存。 
（4）Hepes液：配制濃度1M（5ml/支），一支Hepes加入到200ml 
完全培養(yǎng)基中，終濃度為25mM/ml，常溫保存。 

9.支原體污染及檢測(cè)： 
（1）支原體污染在細(xì)胞培養(yǎng)中最常見、不易被查覺，但支原體污染可顯著影響細(xì)胞功能干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。支原體是介于細(xì)菌和病毒之間的目前所知能獨(dú)立生活的最小微生物，它無細(xì)胞壁，形態(tài)呈高度多形性，最小直徑0.2um，可通過濾器。 

目前通過對(duì)國(guó)內(nèi)100余株/系細(xì)胞的檢測(cè)，形勢(shì)不容樂觀。污染率達(dá)30% ~ 60% 。課題組從國(guó)外引進(jìn)細(xì)胞株/系也經(jīng)常出現(xiàn)支原體的污染。支原體在污染細(xì)胞后，它通過影響細(xì)胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培養(yǎng)基中的氨基酸來抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，并能降低細(xì)胞的融合率。因此，在運(yùn)用各種細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，首先要證明所用細(xì)胞有無支原體的污染。 

（2）支原體污染后，培養(yǎng)基可不發(fā)生渾濁，細(xì)胞病變輕微或不明顯，因此難以發(fā)現(xiàn)。目前，支原體檢測(cè)的方法有以下幾種。 
（a）相差顯微鏡觀察；
（b）.低張?zhí)幚淼匾录t染色法； 
（c）熒光染色法；
（d）酶標(biāo)法； 
（e）PCR法：使用該方法進(jìn)行檢測(cè)。 
優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，檢測(cè)耗時(shí)短，樣品量小 
（只需50ul細(xì)胞培養(yǎng)用液上清）。 
缺點(diǎn)：引物及制劑費(fèi)用較高。

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