膠原酶消化法——培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞

人臍帶間充質(zhì)干細胞具有高度分化潛能，基因穩(wěn)定、不易突變，不會引起腫瘤；無需配型、無排異，廣泛應(yīng)用于疾病治療及抗衰老研究。目前，在美容行業(yè)及針對亞健康群體的應(yīng)用，也越來越引人注目。

臍帶間充質(zhì)干細胞臍帶是由包膜、華通氏膠、臍靜脈、臍動脈臍構(gòu)成。臍帶間充質(zhì)干細胞存在于華通氏膠中。
由于存在數(shù)量少，用膠原酶消化后獲取的細胞量很少。另外，一般的膠原酶消化法獲取細胞時，膠原酶對細胞的傷害較大，培養(yǎng)出來的細胞狀態(tài)差。

貼塊方法培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)細胞是普遍采用的方法，但是，細胞從組織中爬出來的時間長（10-20天，甚至更長）。我們經(jīng)過不斷的摸索，找出一個用膠原酶消化獲取臍帶間充質(zhì)干細胞的方法。

具體操作方法如下：
① 在剪斷連接嬰兒端和母親的臍帶后，立刻用臍帶夾夾住，防止內(nèi)部污染。裝入無菌袋（容器）中，送進實驗室。
② 在生物安全柜或超凈工作臺內(nèi)，取出臍帶，連同臍帶夾用75%的酒精泡2min（50ml離心管或250px皿）。如果臍帶較長，無法裝入容器，可以把臍帶剪成250px左右，但是剪斷之前一定要用臍帶夾加好，防止酒精進入臍帶內(nèi)部，損傷細胞。
③ 用酒精處理完，迅速移入裝有PBS或生理鹽水的容器中浸泡清洗2次，每次2min即可。
④ 剪掉臍帶夾，把臍帶剪成2-75px段，用剪刀從臍靜脈內(nèi)側(cè)剖開臍帶，用帶齒鑷子（臍帶組織比較滑，用帶齒鑷子好操作）把臍靜脈、臍動脈以及臍帶包膜去除，防止雜細胞混入。
⑤ 用剪刀剪碎臍帶組織，0.1%Ⅱ型膠原酶（稀釋液用DMEM/F12）過夜消化，4℃過夜消化。
⑥ 第二天，把未消化完的組織倒到100目（80目、160目都可以）的鋼制篩網(wǎng)上（最好是鋼制網(wǎng)篩，承載的組織量大，便于操作），用PBS（或生理鹽水）多次沖洗，盡可能去掉附著在組織表面上的膠原酶。最后用完全培養(yǎng)基沖洗1-2次，去除PBS（或生理鹽水）。
⑦ 倒入皿中(放入瓶中操作不方便)，在未消化組織塊上加入少量培養(yǎng)基培養(yǎng)（6ml加2-3ml、10ml加3-4ml）（其目的是減少殘存膠原酶對細胞的傷害）。次日，組織塊完全消失（被浸入到組織中的膠原酶消化掉了），細胞完全被分散開，顯微鏡下可以看到已經(jīng)消化完的組織中有許多被分散的細胞。再加入少量培養(yǎng)基（150px加2-3ml、250px加4-5ml）加入培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。
⑧ 兩天后繼續(xù)添加少量培養(yǎng)基（150px加2-3ml、250px加4-5ml）培養(yǎng)。
⑨ 一兩天后，細胞數(shù)量會有明顯增加（許多成集落生長），分別移入兩個50ml離心管中，加入PBS（或生理鹽水）至50ml，混勻，2500rpm、6min離心。
⑩ 用5-6ml（根據(jù)細胞量）完全培養(yǎng)基重懸，1000rpm、6min離心，鋪到T25瓶中，加入5ml完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。
⑪ 三天后，可以換液或添加3-4ml完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。之后每三天換液，直至長滿（70%以上即可傳代）

啟示注意事項：
① 此方法具有易于操作，培養(yǎng)時間短的特點。
② 用膠原酶消化臍帶，37℃下，數(shù)小時以內(nèi)基本能夠把臍帶消化完，但同時對細胞的傷害較大。膠原酶能夠浸透到臍帶組織內(nèi)部，低濃度的膠原酶從內(nèi)到外消化組織，對細胞傷害較小。（胰蛋白酶對臍帶組織消化效果非常差）
③ 徹底消化完組織，并沒有單獨把細胞分離出來的原因，是臍帶膠原成分（粘稠）會促使臍帶間充質(zhì)干細胞增殖。多數(shù)細胞懸浮在膠原當(dāng)中，以集落方式增殖，這是鋪到瓶中，細胞保持良好狀態(tài)的主要原因。
④ 培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞時，不要用帶有血清的培養(yǎng)基（血清會促進細胞分化），而是用干細胞專用培養(yǎng)基。傳代也盡量不用胰蛋白酶消化（胰蛋白酶對臍帶間充質(zhì)干細胞傷害大），應(yīng)該采用專用消化液，能夠保證細胞更多的傳代次數(shù)。