免疫化學(xué)發(fā)光（CLIA）試劑盒在生物磁性分離生產(chǎn)環(huán)節(jié)的5個關(guān)鍵性誤區(qū)

化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescent immunoassay,CLIA)將高靈敏的化學(xué)發(fā)光技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)結(jié)合起來，建立了化學(xué)發(fā)光免疫分析法�；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、線性范圍寬、操作簡便和使用成本低等特點。另外，化學(xué)發(fā)光技術(shù)應(yīng)用范圍較廣，既可檢測不同分子大小的抗原、半抗原和抗體，又可用于核酸探針的檢測。由于其優(yōu)勢，基于這一技術(shù)的體外診斷測試數(shù)量與日俱增。因此，CLIA 診斷試劑盒的需求量已開始飆升，但早期的小規(guī)模生產(chǎn)、純?nèi)斯げ僮骱筒煌晟频馁|(zhì)量控制手段已經(jīng)無法應(yīng)付大規(guī)模生產(chǎn)的需要。如何確保批次間的一致性? 如何確保放大生產(chǎn)規(guī)模后質(zhì)量的穩(wěn)定性? 如何確保成品應(yīng)用的有效性（最終在分析儀中只使用不超過幾百微升）? 這些方面的內(nèi)容是CLIA 診斷試劑盒生產(chǎn)的關(guān)鍵。在近二十年的發(fā)展過程中，我們發(fā)現(xiàn)了五個在生物磁性分離過程中的關(guān)鍵誤區(qū)。這些誤區(qū)容易被忽略但常常延誤項目進(jìn)度，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，有時甚至?xí)�使生產(chǎn)陷入風(fēng)險。因此正確掌握磁性分離的技術(shù)信息是確保產(chǎn)品研發(fā)和生產(chǎn)成功的關(guān)鍵。
如何描述一個生物磁分離過程？
 
當(dāng)一個新的CLIA-IVD試劑盒從研發(fā)階段轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)階段時，所有的生產(chǎn)操作參數(shù)都需要重新調(diào)整以適應(yīng)新的處理體積和產(chǎn)量。生物標(biāo)志物的規(guī)格、緩沖液和包被的操作都得益于非磁性試劑盒生產(chǎn)時所積累的經(jīng)驗。抗體與磁珠的偶聯(lián)、膠體金或乳膠微球很相似，但清洗環(huán)節(jié)的操作使用磁性分離這一方法與其他非CLIA-IVD試劑盒生產(chǎn)有很大區(qū)別。

雖然CLIA試劑盒在生產(chǎn)的分離階段使用生物磁性分離似乎是顯而易見的選擇，但在實踐的過程中仍存在著一些問題。第一是描述整個流程本身，當(dāng)和診斷試劑盒制造企業(yè)溝通時，發(fā)現(xiàn)在生物磁分離方面，他們經(jīng)常提到如下幾個問題：

• 分離時間：從緩沖液體系中分離固相的時間。
• 磁珠損耗：生產(chǎn)過程中丟失的磁珠（和偶聯(lián)的生物標(biāo)志物）的最大值。
• 批次處理體積：所需處理的批次大小，甚至一些情況下處理體積有彈性。
• 要避免不可逆的聚集：在生產(chǎn)的過程中，如發(fā)生不可逆的磁珠聚集需要采取多種方式使之重新懸浮，懸浮后必須檢查是否處理得當(dāng)。因為每一個試劑盒（毫升級別）都需要相同的性質(zhì)，錯誤的重懸浮處理會增大批次間的差異。

但是，以上這些都是“功能性”的參數(shù)，他們是磁性分離的結(jié)果而非影響分離過程的因素。在整個生物磁性分離的過程中，真正缺失但定義了整個分離過程的參數(shù)是什么呢？
在生物磁分離過程的關(guān)鍵參數(shù)是磁力。磁珠以特定的速度移動，這是由于磁力和阻力之間的競爭而產(chǎn)生的凈力，后者是由緩沖液粘度引起的。
  在選擇磁珠時，用戶很關(guān)心是否選擇了“正確”的磁珠。假設(shè)已經(jīng)選擇好了合適的生物標(biāo)志物和完美的耦聯(lián)/包被方式，那么接下來用戶選擇“正確”的磁珠就應(yīng)該具有如下一些特征：
1）高回收率/快速分離。匹配在分析設(shè)備中的時間，磁性分離速度足夠快，在大規(guī)模生產(chǎn)過程中沒有大量磁珠和耦合的生物標(biāo)志物損失。

2）無聚集問題。磁珠可被輕松的重混懸浮。即使磁珠聚集也可以通過幾個額外的超聲處理步驟進(jìn)行處理就可恢復(fù)（但這在大體積生產(chǎn)過程中難以控制和操作）。

3）低批次間差異。每一批等分（通常小于毫升級別）和生產(chǎn)批次（公升級別）必須一致。如果沒有，差異會影響分析器給出的結(jié)果。

如果以上要求沒有達(dá)到會如何？
對有缺陷的磁力分離結(jié)果，試劑盒生產(chǎn)企業(yè)普遍的反應(yīng)是磁珠的選擇是“錯誤”的。然后生產(chǎn)企業(yè)聯(lián)系磁珠供應(yīng)商（或替代供應(yīng)商）關(guān)于磁珠進(jìn)行長期的討論，重審包被方法等，如果一旦陷入這個階段，新產(chǎn)品的研發(fā)和推出將被嚴(yán)重影響，進(jìn)度將大大延后。
 

提示：如果生物標(biāo)記物能很好的耦聯(lián)在磁珠上，遇到問題就更換磁珠將是一個昂貴而又耗時的做法，同時問題仍然也得不到有效的解決。

生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)擺脫對“正確”和“錯誤”磁珠的糾結(jié)，而把重點關(guān)注放在對生物磁性分離的過程和設(shè)備上。通過對比下圖，我們可以發(fā)現(xiàn)同樣懸浮的磁珠在不同生物磁性分離器的作用下會表現(xiàn)出完全不同的情況。 圖2 顯示左邊的傳統(tǒng)磁力架（藍(lán)色）處理的磁珠緩慢分離開。這意味著更長的時間才能完成分離或承受更高磁珠和生物標(biāo)記物的損失。然而，如果等待較長的分離時間以避免損失，一些磁珠將受到不可逆的聚集問題的影響。
 
因為先分離的磁珠（接近瓶壁的位置）受到非常強的磁力，將磁珠擠壓在一起。如果在這一分離步驟，我們不考慮分離設(shè)備的影響，只從磁珠分離的表現(xiàn)來進(jìn)行判斷，那么我們將得到一個錯誤的結(jié)論：我們必須更換其它磁珠來解決問題。同時，從圖2我們可以觀察到，相同的磁珠懸浮液通過先進(jìn)的生物磁性分離設(shè)備（右邊橙色）的結(jié)果我們可以看到分離情況卻是完全不同的，磁珠在相同的速度下快速得到分離，同時由于均勻的磁力，貼壁的磁珠在更短的時間內(nèi)受到溫和磁力的作用，消除了不可逆的聚集風(fēng)險。

建議：與其考慮不斷更換磁珠，我們更應(yīng)該更快捷、更經(jīng)濟(jì)地去挖掘出源于磁性分離設(shè)備的問題和因素。當(dāng)調(diào)整了磁性分離設(shè)備后，如果磁珠能正常懸浮，那么對磁珠的疑慮也就不攻自破了，同時也沒有必要再重建包被的操作工藝。
 
在上一部分我們討論了為什么在分離時一遇到問題就歸咎于磁珠是一個很大的誤區(qū)，在分離過程中引起問題的主要原因是產(chǎn)生磁力的磁鐵而非磁珠。但只光知道應(yīng)調(diào)整磁力而不知如何正確選擇磁鐵也無法解決上述問題。

第二個常見的誤區(qū)是，假設(shè)增大磁鐵就會增強磁力。然而，磁力并不依賴于磁場，而是依賴于磁場梯度。如果磁鐵較小，磁場變得均勻，磁力大大削弱，其結(jié)果是：分離時間過長或更高的原料損耗。如果磁鐵較大，磁場和磁場梯度隨著距離的衰減很快，磁力不足以吸引距離最遠(yuǎn)的磁珠。更糟糕的是接近磁鐵的磁力太大，造成不可逆的磁珠聚集。

在使用了相同數(shù)量的永磁鐵前提下，通過下圖（圖3）比較，大型普通磁鐵和先進(jìn)生物磁分離系統(tǒng)。合適的磁力范圍是確保磁珠能快速分離和降低損失，同時對于貼壁的磁珠提供一個溫和的保留力，確保磁珠吸附在容器壁的同時不會引起不可逆的聚集。在下圖左邊所示，青色部分表示合適磁力的區(qū)域。懸浮在合適分離條件下的磁珠只是這批磁珠的一小部分。在磁鐵附近磁力迅速增加，因此磁珠不可逆聚集的風(fēng)險變高，長時間的分離過程更加劇了這種風(fēng)險。相比之下，先進(jìn)的生物磁分離系統(tǒng)通過調(diào)整磁場分布，產(chǎn)生均勻而溫和的磁力。這意味著整個工作區(qū)域中的磁力是相同的。相比普通磁鐵，在遠(yuǎn)離容器壁的磁珠受到更強的磁力。磁珠的移動速度更快，減少了分離時間，確保了磁珠和偶聯(lián)生物標(biāo)志物的完全回收。在貼壁保留區(qū)，磁力仍然相同，溫和的磁力能確保磁珠貼附在保留區(qū)的同時，不會產(chǎn)生不可逆的聚集。

提示：傳統(tǒng)永磁鐵只能產(chǎn)生一個非常低的磁場梯度，通常離磁鐵只有幾毫米的距離，而遠(yuǎn)端磁力非常低。這意味著磁珠和蛋白/生物標(biāo)志物的大量損失。即使分離操作很長的時間，磁珠也幾乎無法完全分離。所以，如何避免誤區(qū)2：選用更大的磁鐵來避免分離的損耗？我們應(yīng)該用磁力而不是磁場來衡量分離系統(tǒng)，同時磁力需要正確而合理地平衡，因為過強的磁力會導(dǎo)致不可逆的聚集問題。理想的磁性分離系統(tǒng)可為遠(yuǎn)端的區(qū)域和保留區(qū)（貼壁區(qū)）同時提供擇合適的磁力。

第三個常見誤區(qū)涉及分離過程的驗證。很多情況下，生物磁分離過程往往是通過一個指定的分離時間來進(jìn)行驗證。這種驗證方法的問題在于驗證與特定的磁場輪廓和容器大小相關(guān)聯(lián)，而且分離時間僅僅是速度（與磁力成正比）和磁珠所運動距離的結(jié)果，分離時間并不能用來描述磁珠分離的過程條件。

為了更好地驗證分離過程，我們需要額外的信息來闡述這一分離過程。一種方法是光學(xué)監(jiān)測懸浮液通透性的變化過程（在分離起始階段懸浮液是渾濁的，磁珠一旦開始分離，液相就會趨于通透）。這樣，驗證可以不僅在結(jié)束階段（分離時間），而在整個生物分離的過程中，容器內(nèi)的變化都可被觀察和記錄。 如果生物磁分離系統(tǒng)具有良好定義的條件（即均勻磁力），不透明度隨時間變化的曲線通常會形成“S”形。定義該曲線的兩參數(shù)指數(shù)P與時間t50分別反映曲線的斜率和分離時間達(dá)到一半時最大和最小的不透明度之間的差異。這兩個參數(shù)取決于一些源于磁珠（直徑、磁性含量%、磁性材料）和懸浮液（緩沖液粘度、磁珠濃度等）的特性。由于測量曲線的形狀受所有這些參數(shù)的影響，因此監(jiān)測可以為不同的分離過程建立特定的參考數(shù)據(jù)和曲線。當(dāng)固定了磁性分離條件后，同類的分離過程的驗證就應(yīng)遵循相對應(yīng)的參考曲線。

當(dāng)整個過程可被監(jiān)控而不僅是單獨通過分離時間來判斷時，過程中的質(zhì)量問題可以更快地被發(fā)現(xiàn)。通過對比與參考曲線的偏差可以發(fā)現(xiàn)眾多生物磁性分離過程中的生產(chǎn)問題（聚集、不正確的磁珠特征和磁珠濃度等）。這意味著生產(chǎn)人員可以更早地采取糾正措施，從而降低成本損失。