多熒光成像技術(shù)助力蛋白質(zhì)結(jié)晶的靈敏檢測

研究問題：

生物晶體的明確和可靠鑒定仍然是晶體學(xué)研究的主要障礙，尤其是在初始篩選實驗的關(guān)鍵階段。而在可見光范圍內(nèi)以高分辨率自動成像通常不足以識別能夠或可能形成晶體的所有條件。

微量熒光標記

內(nèi)在熒光主要取決于天然存在的色氨酸的量，而一種可能克服內(nèi)在熒光缺點的辦法是微量熒光標記 (TFL)。已確定的實驗方案包括在結(jié)晶前立即用各種熒光染料快速標記 0.1% 的樣品。多重標記除了與固有熒光相比顯著增強的信噪比外，還可用于驗證晶體中多亞基復(fù)合物的存在。

使用 MFI 對晶體進行靈敏檢測

紫外光和 TFL 成像成為了晶體檢測的替代工具。

多熒光成像 (MFI) 提供了可供用戶選擇的 3 種不同波長下成像的靈活性，包括紫外和可見熒光，以輕松檢測蛋白質(zhì)晶體，即使是那些掩埋在沉淀下的晶體。

紫外光通過紫外成像照射蛋白液滴，由芳香族氨基酸（如色氨酸）產(chǎn)生的熒光被檢測到以創(chuàng)建圖像。通過僅用熒光團標記 0.1% 的樣品，TFL 還能夠檢測幾乎不含色氨酸的蛋白質(zhì)。

發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物

借助多熒光成像 (MFI)，用戶現(xiàn)在可以區(qū)分蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物的晶體和單一蛋白質(zhì)的晶體。簡單來說，先用兩種不同的胺活性染料標記兩種可疑的蛋白質(zhì)或亞基，然后在兩個相應(yīng)的波長下對液滴進行成像。在兩種波長上都發(fā)出熒光的晶體是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物，而那些只在一種波長上發(fā)出熒光的晶體是單一蛋白質(zhì)。

大范圍的放大倍率

借助 3 個物鏡，用戶可以縮小以查看整個液滴或放大以更詳細地查看晶體。9MP 圖像的數(shù)字縮放能讓用戶將 FOV 直接與可見圖像匹配。

3 種不同的波長下的成像

用戶可以選擇多達 3 種不同的光波長來對晶體進行成像，包括紫外線和各種可見光波長�？苫�換的濾光片模塊能夠最大限度地提高圖像質(zhì)量和染料標簽的兼容性。

一次最多可以安裝三個過濾器模塊，并且可以輕松切換。默認濾光片配置包括：UV 熒光、熒光素和 Texas 紅濾光片組。

持久的快速和安全標記

簡單的 0.1% 蛋白質(zhì)標記方案

1. 制備 5mM 琥珀酰亞胺酯染料在 DMSO 中的儲備溶液。

2. 假設(shè)對胺殘基的化學(xué)計量標記效率為 1:1，則在蛋白質(zhì)溶液中加入適量的染料，以 0.1% 標記賴氨酸殘基。

3. 等待 5 分鐘，此時 90% 的染料被結(jié)合。

    

無需純化，且樣品在 120 天后仍有熒光。已證明用熒光團標記蛋白質(zhì)對結(jié)晶沒有已知的負面影響，并且其被證明是一種有效識別蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法。