熒光定量PCR應(yīng)用—病毒篇

上篇已經(jīng)介紹過熒光定量PCR原理及在腫瘤檢測方面的應(yīng)用，此篇將以三種病毒的檢測來展現(xiàn)熒光定量PCR強(qiáng)大威力。

諾如病毒

諾如病毒（Norovirus，NVs）屬于杯狀病毒科諾如病毒屬，是引起非細(xì)菌性急性胃腸炎的主要病原體，世界50%以上的胃腸炎暴發(fā)均由它引起，可在醫(yī)院、學(xué)校、餐館等人群密集地爆發(fā)急性胃腸炎。

根據(jù)病毒RNA 聚合酶和衣殼蛋白核苷酸序列的差異，諾如病毒分為5個(gè)基因型，其中GI、GII 型諾如病毒是世界范圍內(nèi)最常見的基因型。近年來，國內(nèi)由諾如病毒引起的急性胃腸炎疫情的報(bào)道逐漸增多，日益成為重要的公共衛(wèi)生問題。因此，建立快速、特異、靈敏的檢測方法對該病的防控具有重要意義。

檢測諾如病毒的方法有電鏡法、免疫法和分子生物學(xué)等方法，電鏡法是最早的檢測方法，但靈度低，而且樣品處理過程復(fù)雜、技術(shù)要求高，不利于臨床應(yīng)用。免疫法應(yīng)用比較多的是酶聯(lián)免疫法，雖快速靈敏，但假陽性率高，檢出率低。而以RT-PCR為主的分子生物學(xué)檢測方法因準(zhǔn)確、快速、特異性好、靈敏度高而被廣泛應(yīng)用，其中熒光定量RT-PCR方法不僅能定性檢測諾如病毒，還能定量分析，這對于致病劑量和風(fēng)險(xiǎn)評估的后期研究有著重要的意義。

有研究人員設(shè)計(jì)諾如病毒和副溶血性弧菌特異性引物，建立諾如病毒和副溶血性弧菌多重?zé)晒舛�量PCＲ 檢測方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性好的特點(diǎn)，將能最大程度地避免死亡病原體的干擾以及排除非致病病原體的干擾。諾如病毒和副溶血性弧菌合檢技術(shù)的建立，通過對全球傳播范圍最廣、影響最大的2 種病原體的聯(lián)合檢測，有助于對腸道傳染病檢測技術(shù)的建立和深化，同時(shí)更加便利實(shí)驗(yàn)檢測工作，為傳染病早期診斷、控制疫情贏得寶貴時(shí)間，對食品安全檢測、傳染病暴發(fā)溯源和預(yù)警也將帶來積極的作用。

還有研究報(bào)道同時(shí)檢測輪狀病毒、GⅠ型諾如病毒和GⅡ型諾如病毒多重?zé)晒釶CR方法，而且該技術(shù)容易掌握，適合基礎(chǔ)單位應(yīng)用，也為突發(fā)性腹瀉疾病暴發(fā)時(shí)病因的診斷提供了一個(gè)新的診斷方法。

乙肝病毒

據(jù)估計(jì)，全球大約有3億左右的乙肝病毒（HBV）攜帶者，我國是乙肝的高發(fā)區(qū)域之一。乙肝作為目前危害最為嚴(yán)重、流行性最廣泛的病毒性肝炎，其早期診治方法一直是臨床研究的重點(diǎn)內(nèi)容。

乙肝出現(xiàn)的直接原因?yàn)橐倚透窝撞《靖腥�，另外家族性傳播、嬰幼兒期感染病毒、缺乏預(yù)防意識、漏診、既往有其他肝病史感染病毒等也是乙肝的主要發(fā)病原因。乙肝的傳染源為乙型肝炎患者和乙型肝炎病毒攜帶者，乙肝的潛伏期為6 周～ 6 個(gè)月，乙型肝炎病毒的傳播途徑包括血和血液制品傳播、母嬰傳播、性接觸傳播、經(jīng)破損的皮膚黏膜傳播，具有較強(qiáng)的傳染性，感染乙型肝炎病毒后，受多種因素的影響，患者會出現(xiàn)不同的乙肝類型。

乙肝患者若未得到及時(shí)、有效的治療，會向肝纖維化、肝硬化、原發(fā)性肝癌進(jìn)展，故此盡早診斷乙肝，有利于及時(shí)采取有效的治療措施控制病情進(jìn)展，控制傳染源，促進(jìn)預(yù)后效果的提高,臨床意義重大。

乙肝病毒HBV的臨床檢測

熒光定量PCR檢測的是HBV本身的遺傳物質(zhì)—DNA，是病毒存在和復(fù)制的最可靠、最直接的指標(biāo)�！皵y帶者”、“大三陽”、“小三陽”等免疫學(xué)指標(biāo)不能反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制水平與感染程度。另外，血清學(xué)指標(biāo)(－)不能排除HBV感染，也可能出現(xiàn)血清學(xué)指標(biāo)陽性，HBV-DNA(－)；但也應(yīng)注意到由于HBV-DNA檢測低限的限制，因此臨床上應(yīng)將ELISA定性與PCR定量檢測綜合運(yùn)用于乙肝病毒的臨床檢測中。

近幾年興起的高靈敏熒光定量 PCR 技術(shù)，其檢測下限遠(yuǎn)優(yōu)于普通熒光定量 PCR 技術(shù)，檢測下限可達(dá)到 20 IU/ml，普通熒光定量 PCR技術(shù)的檢測下限一般為 500 IU/ml。高靈敏熒光定量 PCR 技術(shù)具有特異性高、靈敏度高以及結(jié)果得出速度快的優(yōu)點(diǎn)，在檢測乙肝病毒中可通過 DNA 體外擴(kuò)增技術(shù)定量檢測患者血清中的 HBV-DNA 病毒載量，對乙肝患者血液內(nèi)病毒的復(fù)制情況進(jìn)行明確，其還能有效反映 HBV 自身拷貝數(shù)、HBV 的感染和恢復(fù)情況，為臨床治療的效果、預(yù)后效果進(jìn)行評價(jià)，有利于臨床及時(shí)調(diào)整抗病毒治療方案，促進(jìn)臨床治療效果的提升。  

HBV-DNA定量檢測的臨床意義

治療前：

• 治療前HBV低水平復(fù)制者對干擾素的反應(yīng)性明顯優(yōu)于高水平復(fù)制者。

• 治療前HBV DNA 含量特別高者大多沒有療效。

• HBsAg轉(zhuǎn)陰的幾乎都是那些治療前血清HBV DNA 含量較低者。

治療中：

• 病毒復(fù)制水平迅速降低者，有望治愈。

• 相反，治療期間HBV DNA復(fù)制水平下降較慢，或下降幅度較小，或者變化不明顯者，大多是干擾素治療無效。

治療后：

• 治療結(jié)束后，采用PCR定量法檢測，HBV DNA <103 copy/ml 者，可能不再復(fù)發(fā)。

• 終止治療后HBV DNA 仍保持較低水平者，反跳的可能性較大。

1. • 含量高者急性肝炎患者易慢性化，癌變的幾率明顯高于含量低者。

     此外，HBV-DNA定量檢測還有助于指導(dǎo)懷孕與孕期，哺乳期檢查；為肝臟移植提供數(shù)據(jù)支持；對血液制品和獻(xiàn)血員的篩選等方面。

H7N9禽流感病毒

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）屬于正黏病毒科Ａ 型流感病毒屬。根據(jù)其表面糖蛋白血凝（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗原性差異，分為16種HA和9種NA。野生水禽是禽流感病毒的自然宿主，一般對其是不致病的，當(dāng)它們傳染給其他物種時(shí)有時(shí)會造成大的發(fā)病率和死亡率，給人類和動物的健康帶來巨大威脅。2013年中國首次報(bào)道人感染H7N9禽流感病毒的病例，截止2015年2月共有571例感染，212人死亡。H9N9 AIV 病毒是一種低致病性禽流感病毒，它引起家禽很輕微的或不引起臨床癥狀，且很難在環(huán)境中檢測。H7N9禽流感病毒的疫情防控比高致病性禽流感病毒H5N1難度更大，因此病毒的監(jiān)測至關(guān)重要。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法是WHO推薦的H7N9定量檢測方法，由于是直接檢測病原體核酸，該方法具有高敏感，高特異和短檢測窗口期等優(yōu)點(diǎn)，為疫病早診斷、早治療、降低病死率以及控制疫情爭取時(shí)間。針對有些臨床需要，除能夠依據(jù)陰陽性判斷確證病例以外還可以依據(jù)核酸的載量判斷感染程度。

但由于H7N9序列的突變，需要根據(jù)我國國情設(shè)計(jì)新的引物和探針序列。有研究設(shè)計(jì)的四重?zé)晒舛�量PCR 方法能在1 個(gè)反應(yīng)管里靈敏并特異地檢測Flu A、H7、N9及ＲNase P，較WHO 推薦的方法，縮短了檢測周期、顯著簡化了實(shí)驗(yàn)程序并降低實(shí)驗(yàn)費(fèi)用。

北京市研制的甲型H7N9流感病毒RNA檢測試劑盒可在兩個(gè)半小時(shí)內(nèi)篩查出人是否感染H7N9病毒，將有效保障甲型H7N9流感病毒的防控工作。

鑒于熒光定量PCR技術(shù)在病毒感染早期的快速檢測，及預(yù)后效果評估方面的靈敏性和有效性，大量基于該技術(shù)的病毒檢測試劑盒得到了很好的市場反饋，病毒檢測試劑盒產(chǎn)品在食品安全、疾病預(yù)防控制和醫(yī)療等市場得到廣泛應(yīng)用。