實(shí)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)手冊(cè)（上）

細(xì)胞培養(yǎng)基本概念

細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞在體外模擬體內(nèi)環(huán)境下，使其生長(zhǎng)繁殖，并維持其結(jié) 構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物可以是單個(gè)細(xì)胞，也可以是細(xì)胞群。

細(xì)胞培養(yǎng)目的與用途

1、科學(xué)研究：藥物研究開(kāi)發(fā)與基礎(chǔ)研究 藥物研究與開(kāi)發(fā)

(1) 新藥篩選：如化學(xué)合成藥物藥效研究、中藥有效成分篩選與鑒定等。

(2) 疫苗研究與開(kāi)發(fā)：如病毒性疫苗的研究與開(kāi)發(fā)（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、腫 瘤疫苗(多肽疫苗)等。

(3) 基因工程藥物研究與開(kāi)發(fā)：如干擾素研究與開(kāi)發(fā)，細(xì)胞生長(zhǎng)因子研究與開(kāi)發(fā)等。

(4) 細(xì)胞工程藥物研究與開(kāi)發(fā)：生物活性多肽研究與開(kāi)發(fā)，人參皂甙、紫杉醇等生物活 性成分研究與開(kāi)發(fā)。

(5) 單克隆抗體制備：包括診斷用單克隆抗體，治療用單克隆抗體。

基礎(chǔ)研究

(1) 藥物作用機(jī)理

(2) 基因功能

(3) 疾病發(fā)生機(jī)理

2、 生物制藥

(1) 疫苗生產(chǎn)：如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、腫瘤疫苗(多肽疫苗)

等。

(2) 基因工程藥物生產(chǎn)：如在臨床醫(yī)學(xué)中具有治療價(jià)值的一些細(xì)胞生長(zhǎng)因子如干擾素、 粒細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胸腺肽等

(3) 診斷用和藥用單克隆抗體生產(chǎn)

(4) 細(xì)胞工程藥物生產(chǎn)：生物細(xì)胞內(nèi)的一些生物活性多肽，生物活性物質(zhì)等

細(xì)胞培養(yǎng)基本條件

1、合適的細(xì)胞培養(yǎng)基

合適的細(xì)胞培養(yǎng)基是體外細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的最重要的條件之一，培養(yǎng)基不僅提供細(xì)胞營(yíng)養(yǎng) 和促使細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，而且還提供培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境。

2、優(yōu)質(zhì)血清

目前，大多數(shù)合成培養(yǎng)基都需要添加血清。血清是細(xì)胞培養(yǎng)液中最重要的成分之一，含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的多種生長(zhǎng)因子及其它營(yíng)養(yǎng)成分。

 

3、無(wú)菌無(wú)毒細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境

無(wú)菌無(wú)毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細(xì)胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件。在體外培養(yǎng) 的細(xì)胞由于缺乏對(duì)微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染，或者 自身代謝物質(zhì)積累，可導(dǎo)致細(xì)胞中毒死亡。因此，在體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，必須保持細(xì)胞 生存環(huán)境無(wú)菌無(wú)毒，及時(shí)清除細(xì)胞代謝產(chǎn)物。

4、恒定的細(xì)胞生長(zhǎng)溫度

維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長(zhǎng)，必須有恒定適宜的溫度。

5、合適的氣體環(huán)境

氣體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。

細(xì)胞培養(yǎng)基種類(lèi)與基本成分

細(xì)胞培養(yǎng)基的種類(lèi)很多，按其來(lái)源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基（目前使用的培養(yǎng)基 絕大部分是合成培養(yǎng)基），按其物質(zhì)狀態(tài)分為干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類(lèi)。干粉培養(yǎng)基 需由實(shí)驗(yàn)者自己配制并滅菌，液體培養(yǎng)基由專(zhuān)業(yè)商家提供，用戶(hù)可直接使用，非常方便。 每種細(xì)胞都有其合適的培養(yǎng)基，詳見(jiàn)附表 1。

1、合成培養(yǎng)基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽、維生素及其它輔助物質(zhì)

氨基酸

氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類(lèi)的細(xì)胞對(duì)氨基酸的要求各異，但有幾種氨 基酸細(xì)胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾種氨基酸稱(chēng)為必需氨基酸。其中谷氨

酰胺是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)不良而死亡。

因此，各種培養(yǎng)液中都有較大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng) 置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在 4℃冰箱中儲(chǔ) 存 2 周以上時(shí)，還應(yīng)重新加入原來(lái)量的谷氨酰胺。

碳水化合物

碳水化合物是細(xì)胞生長(zhǎng)主要能量來(lái)源，其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸等。

無(wú)機(jī)鹽

培養(yǎng)液中無(wú)機(jī)鹽的主要功能是幫助細(xì)胞維持滲透壓平衡。此外，通過(guò)提供鈉，鉀和鈣 離子，幫助細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞膜功能。培養(yǎng)液的滲透壓是一個(gè)非常重要的因素, 細(xì)胞通常可耐 受 260mOsm/kg −320 mOsm/kg。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內(nèi)波動(dòng)。特別注意：向培 養(yǎng)液中加入其它物質(zhì)有可能會(huì)明顯改變培養(yǎng)液的滲透壓，特別是溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿中的物 質(zhì)。向培養(yǎng)液中添加 HEPES 時(shí)需按以下方法調(diào)節(jié)鈉離子濃度。

緩沖系統(tǒng)

大多數(shù)細(xì)胞所需 pH 在 7.2 - 7.4。但是，細(xì)胞培養(yǎng)最適 pH 值隨培養(yǎng)的細(xì)胞種類(lèi)不同而 不同。成纖維細(xì)胞喜歡較高 pH (7.4 - 7.7), 而傳代轉(zhuǎn)化細(xì)胞系則需要偏酸 pH (7.0 - 7.4)。 由于多數(shù)培養(yǎng)液靠碳酸氫鈉（NaHCO3）與 CO2 體系進(jìn)行緩沖，因此，氣相中的 CO2 濃度 應(yīng)與培養(yǎng)液中碳酸氫鈉濃度相平衡。如果氣相或培養(yǎng)箱空氣中 CO2 濃度設(shè)定在 5％，培養(yǎng)液中 NaHCO3 的加入量為 1.97g/L；如果 CO2 濃度維持在 10％，培養(yǎng)液中 NaHCO3 的加入量為 3.95g/L。細(xì)胞培養(yǎng)瓶蓋不應(yīng)擰得太緊，以保證氣體交換。

HEPES 是一種非離子緩沖液，在 pH 7.2 - 7.4 范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力，但是非 常昂貴，在高濃度時(shí)對(duì)一些細(xì)胞可能有毒。HEPES 緩沖液可與低水平的碳酸鈉（0.34g/L） 共用，以抵消因額外加入 HEPES 引起的滲透壓增加。在這種培養(yǎng)條件下，細(xì)胞培養(yǎng)瓶的 蓋子應(yīng)擰緊，以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。大多數(shù)培養(yǎng)液中含有酚紅作 為 pH 指示劑，酸性培養(yǎng)液呈橙黃色，堿性培養(yǎng)液呈深紅色。

維生素

在細(xì)胞培養(yǎng)中，盡管血清是維生素重要來(lái)源， 但是許多培養(yǎng)基中添加了各種維生素以 適合更多的細(xì)胞系生長(zhǎng)。

其它成分

在一些較為復(fù)雜的培養(yǎng)液中還包括其它一些成分。如在雜交瘤技術(shù)中常用的 DMEM 培 養(yǎng)液，使用時(shí)還需要補(bǔ)加丙酮酸鈉和 2-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol，2-Me）。2-Me 對(duì)細(xì) 胞生長(zhǎng)有很重要的作用。有人認(rèn)為它相當(dāng)于胎牛血清，有直接刺激細(xì)胞增殖作用。2-Me 的活性部分是硫氫基，其中一個(gè)重要作用是使血清中含硫的化合物還原成谷胱甘肽，能誘 導(dǎo)細(xì)胞的增殖，為非特異性的激活作用。同時(shí)避免過(guò)氧化物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的損害。另一個(gè)重 要作用是促進(jìn)分裂原的反應(yīng)和 DNA 合成，增加植物凝集素(PHA)對(duì)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用， 已廣泛應(yīng)用于雜交瘤技術(shù)，另外，也開(kāi)始用于一些難以培養(yǎng)的細(xì)胞。2-Me 是一種小分子 還原劑，極易氧化。分子量為 78.13，純的 2-Me 是一種無(wú)色有刺激味的液體，比重為1.110-1.120(Do20)，常用終濃度為 5×10-5M。常配制成 0.1M 的儲(chǔ)存液，用時(shí)每升培養(yǎng)液 加 0.5ml。

液體培養(yǎng)基保存：

液體培養(yǎng)基應(yīng)于 4℃冰箱避光保存，實(shí)驗(yàn)前放入 37℃預(yù)熱。未加血清液體培養(yǎng)基有 效期為 12 個(gè)月。液體培養(yǎng)基中的 L-谷氨酰胺會(huì)隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而慢慢分解。如果 細(xì)胞生長(zhǎng)不良，可以再添加適量 L-谷氨酰胺。

干粉培養(yǎng)基保存：4℃冰箱避光保存，有效期 36 個(gè)月。

血清

細(xì)胞培養(yǎng)液中添加的血清有牛血清、馬血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清， 分為胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清，價(jià)格 昂貴。新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來(lái)的血清，如廠(chǎng)家能做到這一 點(diǎn)，新生小牛血清的質(zhì)量與胎牛血清的質(zhì)量相差不大。如小牛出生后已哺乳，從這種小牛 中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質(zhì)，其質(zhì)量明顯不如前兩種。

血清的質(zhì)量，種類(lèi)及使用的濃度都有可能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，而不同批次的血清支持細(xì) 胞生長(zhǎng)的能力也不同，尤其是對(duì)克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)，某些批次血清可能含有毒性或抑制細(xì)胞 生長(zhǎng)的物質(zhì)。因此，在購(gòu)買(mǎi)大量血清之前，必須對(duì)血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)能力進(jìn)行檢測(cè)，然后再，然后大量購(gòu)買(mǎi)質(zhì)量好的同一批號(hào)的血清，并注意以下幾點(diǎn)：

（1）需要長(zhǎng)期保存的血清必須儲(chǔ)存于-20℃ – 70℃ 低溫冰箱中。4℃冰箱中保存時(shí)間切 勿超過(guò) 1 個(gè)月。由于血清結(jié)冰時(shí)體積會(huì)增加約 10％，因此，血清在凍入低溫冰箱前， 必須預(yù)留一定體積空間，否則易發(fā)生污染或玻璃瓶?jī)隽选?/p>

（2）一般廠(chǎng)商提供的血清為無(wú)菌，無(wú)需再過(guò)濾除菌。如發(fā)現(xiàn)血清有懸浮物，則可將血清 加入培養(yǎng)液內(nèi)一起過(guò)濾，切勿直接過(guò)濾血清。

（3）瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法：-20℃ 至 -70℃ 低溫冰箱中的血清放入 4℃冰箱 中溶解 1 天。然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。在溶解過(guò)程中需不斷輕輕搖晃均 勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。切勿直接將血清從-20℃進(jìn)入 37℃解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝集而出現(xiàn)沉淀。

（4）熱滅活是指 56℃, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清。加熱過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻。此 熱處理的目的是使血清中的補(bǔ)體成分（complement）滅活。除非必須，一般不建議作 此熱處理，因?yàn)闊崽幚頃?huì)造成血清沉淀物顯著增多，而且還會(huì)影響血清的質(zhì)量。補(bǔ)體 參與反應(yīng)有：細(xì)胞毒作用, 平滑肌細(xì)胞收縮, 肥大細(xì)胞和血小板釋放組胺, 增強(qiáng)吞噬 作用, 促進(jìn)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞發(fā)生化學(xué)趨化和活化。

（5）切勿將血清在 37℃放置太久，否則血清會(huì)變得渾濁，同時(shí)血清中的有效成分會(huì)破會(huì) 而影響血清質(zhì)量。

（6）血清中的沉淀物 絮狀物：主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會(huì)影響血清本身的質(zhì)量。可用離心 3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理。

顯微鏡下“小黑點(diǎn)”：經(jīng)過(guò)熱處理過(guò)的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著增多。有些沉淀物 在顯微鏡下觀(guān)察象“小黑點(diǎn)”，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點(diǎn)不會(huì)影 響細(xì)胞生長(zhǎng)，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立即停止使用，更換另一批號(hào)的血清。