利用SpectraMax MiniMax細(xì)胞計數(shù)儀檢測細(xì)胞周期

前言

球體是小型的3D細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境，可以用于諸如低吸附微孔板等特殊的方法進行細(xì)胞培養(yǎng)。這種體外3D細(xì)胞培養(yǎng)模型具有高度的臨床及生物可靠性，并且已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于高通量篩選(HTS)和高級細(xì)胞培養(yǎng)，從而方便對諸如化合物毒性和癌癥等重大疾病進行研究。Multicellular tumor spheroids(MCTS)可以模擬腫瘤組織，因此其經(jīng)常被用來彌補傳統(tǒng)2D環(huán)境，如在微板上的單層細(xì)胞和動物模型間的缺失。目前3D技術(shù)已經(jīng)被廣泛地接受作為更精確的模擬癌癥細(xì)胞在體內(nèi)的生物學(xué)狀態(tài)和有效評估新的抗癌策略的方法。

FUCCI(fluorescent ubiquitination-basedcell-cycle indicator)小球能鑒別細(xì)胞處在細(xì)胞周期的哪一時期，因此可以用來研究癌癥細(xì)胞周期的進程。FUCCI技術(shù)建立在鑒定過表達的兩種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白geminin和Cdt1水平上，其中g(shù)eminin融合的是綠色熒光基團AmCyan，而Cdt1融合的是紅色熒光基團mCherry。Cdt1和geminin的水平隨著細(xì)胞周期的變化而不斷波動：Cdt1蛋白水平在G1階段達到峰值，而geminin蛋白水平在S，G2和M期不斷升高。這一結(jié)果體現(xiàn)為表達FUCCI細(xì)胞核在G1期為紅色而在S，G2和M期則呈現(xiàn)綠色(圖1)。

SpectraMax^®i3x多功能讀板機配置SpectraMax^®MiniMax^TM300細(xì)胞計數(shù)儀，具有transmittedlight(TL)，綠色(Ex/Em:460/541)和紅色(Ex/Em:625/713)熒光通道。MiniMax細(xì)胞計數(shù)儀的SoftMax^®Pro軟件可以用來獲得各種細(xì)胞的圖像并進行分析。本說明旨在介紹如何利用MiniMax細(xì)胞計數(shù)儀快速高效地獲取及分析FUCCI小球的圖像。

優(yōu)勢

- 應(yīng)用細(xì)胞成像功能實時監(jiān)測細(xì)胞周期進程
- 多參數(shù)分析細(xì)胞球，操作簡便
- SoftMax Pro 軟件可以靈活地自定義細(xì)胞球的分析方法，滿足不同的實驗要求

材料

- SpectraMax i3x 多功能讀板機 (Molecular Devices cat. #i3x)
- SpectraMax MiniMax 300 細(xì)胞成像儀(Molecular Devices cat. #5024062)
- Corning 96-well 低吸附 U 底板 (Corning cat. #7007)
- A375S FUCCI 細(xì)胞 (Institute of CancerResearch 提供, London)
- DMEM / F12 培養(yǎng)基 (Invitrogen cat.#11320-033)
- EGF (Invitrogen cat. #PHG0311)
- B27 補充液 (Invitrogen cat #17504001)

方法

球體的制作和培養(yǎng)

Institute of CancerResearch(ICR)負(fù)責(zé)制造表達FUCCI報告系統(tǒng)mCherry-Cdt1和AmCyan-geminin的細(xì)胞，制作按照Dufau等人發(fā)表的流程進行。A375S FUCCI球體準(zhǔn)備的方法如下：Corning公司96孔U型底低吸附細(xì)胞培養(yǎng)板中加入含有EGF(20ng/mL)和B27(1x)的DMEM/F12培養(yǎng)基，按每孔1,000細(xì)胞進行種板。細(xì)胞板離心(800g，6min)后在37℃，5%CO₂條件下進行孵育。最后，用含10%FCS的培養(yǎng)基清洗球體3次以移除EGF和B27，繼續(xù)培養(yǎng)1至6天。

數(shù)據(jù)分析

MiniMax細(xì)胞計數(shù)儀的透射光模塊可以從自動聚焦得到最佳的圖像效果。SoftMax Pro軟件中的“Field Analysis”能進行自定義分析從而鑒別細(xì)胞重疊的部分。我們應(yīng)用一種特殊的鑒別方法來區(qū)分目標(biāo)球體和其余物體，如殘渣和個體細(xì)胞，從而在后續(xù)的分析中予以去除(Figure2,AandE)。最后，我們選擇感興趣的區(qū)域并從圖像中去除不想要的物體。在綠色和紅色熒光通道中，球體可以通過“Object Count”模式中大小和與背景相對熒光強度的區(qū)別被輕易的篩選出來(Figure2,B-D,F-G)。然后運用SoftMax Pro軟件計算圖像的“%Area coverage”和球體的“Object Area”(μm2)。圖像的獲取和分析的設(shè)置方法見表1。

結(jié)果

SoftMax Pro軟件中獲取及分析的設(shè)置可以在綠色和紅色熒光通道的透射光下簡便快速的分辨每個孔中的單球體。SoftMax Pro軟件還可計算所有通道包含的面積占比和物體面積(μm2)(圖2，表2)。在綠色和紅色熒光通道下可以獲得最好的結(jié)果。

對于FUCCI球體來說，圖2中紅色部分展示的是光滑圓潤的球體而綠色部分則在細(xì)胞表面，說明球體內(nèi)部的細(xì)胞處在G1期而表面細(xì)胞即將進入M期。

對應(yīng)軟件可以分辨球體大小和形狀(球形參數(shù))的各種變化，因此常用來研究多種處理，如抗癌藥物，對細(xì)胞增殖的影響(圖3)。MiniMax中綠色和紅色熒光的光學(xué)成形功能可以將3D圖像轉(zhuǎn)換為2D投射球體圖。

結(jié)論

MiniMax細(xì)胞計數(shù)儀配合SoftMax Pro軟件的整合數(shù)據(jù)分析可以獲取綠色和紅色熒光通道及透射光下FUCCI球體的圖像并進行分析。實驗者可以用多種方法對球體進行評估，包括圖像覆蓋的區(qū)域，目標(biāo)物大小、形狀，從而為實驗者提供了多參數(shù)全景的細(xì)胞數(shù)據(jù)分析。SpectraMax i3x多功能讀板機搭配MiniMax細(xì)胞計數(shù)儀完美的將成像的優(yōu)勢和讀板機的簡便結(jié)合在一起。通過簡化的數(shù)據(jù)采集和分析流程，SoftMax Pro軟件提供了FUCCI球體分析的完整解決方法。

文獻

1. Dufau I, Frongia C, Sicard F, Dedieu L,Cordelier P, Ausseil F, Ducommun B,Valette A: Multicellular Tumor Spheroid model to evaluate spatio-temporaldynamics effect of chemotherapeutics.Application to the gemcitabine / CHK1nhibitor combination in pancreaticcancer. BMC Cancer. 2012, 12 (1):15-10.1186/1471-2407-12-15.
2. Jennifer Laurent, Céline Frongia,Martine Cazales, Odile Mondesert,Bernard Ducommun, Valérie Lobjois:Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D.BMC Cancer. 2013, 13:73, 10.1186/1471-2407-13-73.
3. http://www.di.uq.edu.au/sparq/Dynamic%20tumour%20heterogeneity%20in%20melanoma%20therapy%20resources/Spoerri%20et%20al%20MMB%20accepted.pdf
4. https://www.westburg.eu/products/protein-analysis/fluorescent-proteins/-cell-cycle-fluorescent-reporter-vectors-fucci/$16360