Orflo快速流式細(xì)胞儀助力新型基因編碼鈣指示劑的研究

鈣離子(Ca2+)是機(jī)體各項生理活動不可缺少的離子，是細(xì)胞內(nèi)重要且廣泛存在的第二信使。監(jiān)測活細(xì)胞內(nèi)鈣水平，對探究生物活動相關(guān)的信號機(jī)制及規(guī)律至關(guān)重要。傳統(tǒng)的合成鈣指示劑，使用方便、可靠性高、動態(tài)范圍廣、光譜化學(xué)特性多樣。經(jīng)過優(yōu)化的基因編碼鈣指示劑(GECIs)，在許多應(yīng)用中可與其效果相媲美，尤其是GECIs表達(dá)穩(wěn)定，可有效降低試劑成本，簡化分析過程，比合成鈣指示劑更有優(yōu)勢。

來自Janssen研發(fā)有限責(zé)任公司的Nyantsz Wu等人，構(gòu)建了一個穩(wěn)定表達(dá)GCaMP6s的克隆細(xì)胞系，并通過流式細(xì)胞儀(flow cytometry)和熒光成像(FLIPR)等技術(shù)，對熒光基因編碼鈣指示劑GCaMP6s與合成鈣指示劑fluo-4進(jìn)行了性能比較，相關(guān)研究以“High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator”為題，發(fā)表在《Scientific Reports》上。

實(shí)驗(yàn)中，采用美國Orflo公司的Moxi GO II流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，通過488nm激發(fā)激光和525/45nm發(fā)射濾光片，配合PMT檢測熒光強(qiáng)度，采用Coulter法測定細(xì)胞大小，直徑小于9微米的細(xì)胞被認(rèn)為是碎片，排除在計數(shù)數(shù)據(jù)之外。

 

首先，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對GCaMP6s與fluo-4的熒光光譜進(jìn)行分析，比較fluo-4標(biāo)記293-F細(xì)胞與用pGP-CMV-GCaMP6s轉(zhuǎn)染 24小時的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度（圖1. a-c）

圖1. 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對數(shù)變換熒光強(qiáng)度直方圖. (a)未標(biāo)記細(xì)胞，(b)瞬時表達(dá)pGP-CMV-GCaMP6s，(c)標(biāo)記fu -4的細(xì)胞
（用緩沖液(紅色)或10μM鈣離子通道載體(藍(lán)色)處理細(xì)胞）

然后，基于共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀，對GCaMP6s與fluo-4分別處理的細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化進(jìn)行可視化分析（圖2）。

圖2. 用GCaMP6s(a-c)和fluo -4(d-f)分別標(biāo)記的穩(wěn)定表達(dá)GluA 1o -γ4 293-F細(xì)胞共聚焦圖像和流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果(c,f)懸浮細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)熒光強(qiáng)度直方圖：CP-465022(紅色)，谷氨酸+ LY-395153(橙色)，鈣離子通道載體(藍(lán)色)

最后，對流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行總結(jié)（表）。在每次實(shí)驗(yàn)中，測量所有直徑大于9μm細(xì)胞的計數(shù)平均值(運(yùn)行1,800-11,000個細(xì)胞)。數(shù)據(jù)以每次結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)次數(shù)用括號表示。細(xì)胞處理為CP-465022 (FCP);谷氨酸+LY-395153 (FPAM);鈣離子通道載體 (Fiono)。ΔF為(FPAM -FCP)或(Fiono -FCP)。

 

通過流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可以直接比較兩種熒光指示劑的熒光強(qiáng)度。FLIPR（高通量實(shí)時熒光檢測）實(shí)驗(yàn)測量大約10,000至20,000個細(xì)胞的總熒光強(qiáng)度，可以通過流式細(xì)胞儀測量大約10,000個細(xì)胞的算術(shù)平均值來模擬。研究人員發(fā)現(xiàn)，GCaMP6s標(biāo)記的細(xì)胞在總熒光輸出上比fluo-4標(biāo)記的細(xì)胞低，但足以在FLIPR實(shí)驗(yàn)中提供穩(wěn)健的反應(yīng)。

作為一種新型的熒光基因編碼的鈣指示劑，GCaMP6s具有高親和力、高表達(dá)量，不需要額外的染料加載，降低試劑成本，在細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化的監(jiān)測上顯示出與fluo-4相當(dāng)?shù)膭討B(tài)范圍和響應(yīng)特性。此外，GCaMP6s還可以通過標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行改造，以適應(yīng)特定的實(shí)驗(yàn)需求。文章認(rèn)為GCaMP6s是一個有前景的新型工具，作為合成鈣指示劑的替代品，可以用于各種細(xì)胞生物學(xué)和藥理學(xué)研究，尤其是在需要高通量篩選的現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域。

在這項研究中，Moxi GO II作為一個實(shí)驗(yàn)工具，即開即用，操作簡便，對于實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平檢測至關(guān)重要，對評估GCaMP6s這一遺傳編碼鈣指示劑的性能和應(yīng)用潛力具有重要意義。

 

美國Orflo Technologies公司將行業(yè)公認(rèn)的細(xì)胞計數(shù)金標(biāo)準(zhǔn)——庫爾特原理(Coulter Principle)，與熒光流式檢測技術(shù)相結(jié)合，推出的新一代快速流式細(xì)胞儀——Moxi GO II，提供超準(zhǔn)確的細(xì)胞計數(shù)、細(xì)胞活率檢測，以及超高分辨率的細(xì)胞粒徑測量。庫爾特原理對顆粒個體進(jìn)行逐個三維測量，不但能準(zhǔn)確測量顆粒的粒徑分布，更能進(jìn)行粒子絕對數(shù)目和濃度的測量。由于檢測時不受激光衍射、散射因樣本顏色或濃度變化的影響，庫爾特原理所測粒徑大小更接近真實(shí)。

Moxi GO II快速流式細(xì)胞儀，采用庫爾特原理進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和粒徑測量，同時采用488nm激光光源，結(jié)合兩個PMT通道，525/45nm通道和561nm/LP（或者646nm/LP，可根據(jù)需要更換），進(jìn)行細(xì)胞活率、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)染效率、活性氧簇、線粒體膜電位等常規(guī)流式檢測。儀器設(shè)計小巧輕便，無需預(yù)熱，開機(jī)即用，預(yù)設(shè)程序，觸屏操控，運(yùn)行后10秒即可給出測試結(jié)果，使用后也無需清潔維護(hù)。無論是經(jīng)驗(yàn)豐富的流式專家，還是初試身手的實(shí)驗(yàn)小白，Moxi Go II都可以助您輕松完成實(shí)驗(yàn)。

美國Orflo Technologies公司是一家非常專業(yè)的細(xì)胞分析儀器研發(fā)和制造企業(yè)，擁有多項專利技術(shù)，產(chǎn)品以庫爾特原理的高精細(xì)胞計數(shù)儀和超快流式細(xì)胞儀為主。

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https://doi.org/10.1038/s41598-019-49070-8


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