食品中溶血性鏈球菌的檢驗方法

1、范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中溶血性鏈球菌的檢驗方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品和食物中毒樣品中溶血性鏈球菌的檢驗，
2、規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單〔不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)．GB/T4789.28一2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗染色法、培養(yǎng)基和試劑
3、設(shè)備和材料
3.1冰箱：O℃——4℃。
3.2恒溫培養(yǎng)箱：36℃士1℃。
3.3恒溫水浴鍋：36℃土1℃。
3.4顯微鏡：10*～l00*。
3.5均質(zhì)器或滅菌乳缽。
3.6離心機：4000r/min。
3.7架盤藥物天平：0g——5009，精確至0.5g。
3.8滅菌試管：10mm*100mm、l6mm*160mm。
3.9滅菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、5mL、10mL（具0.1mL刻度）。
3.10滅菌錐形瓶：100mL。
3.11滅菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。
3.12滅菌棉簽、鑷子等。
4、培養(yǎng)基和試劑
4.1葡萄糖肉浸液肉湯：按GB/T4789.28一2003中4.1規(guī)定。在肉浸液肉湯內(nèi)加人1％葡萄糖。
4.2肉浸液肉湯：按GB/T4789.28一2003中4.1規(guī)定。
4.3匹克氏肉湯：按GB/T4789.28一2003中4.62規(guī)定。
4.4血瓊脂平板：按GB/T4789.28一2003中4.6規(guī)定。
4.5人血漿。4.6 0.25%氯化鈣。
4.7 0.85％滅菌生理鹽水。
4.8桿菌膚藥敏紙片（含0.04單位）。
5、操作步驟
5.1樣品處理按無菌操作稱取食品檢樣25g（ml)，加人225mL滅菌生理鹽水，研成勻漿制成混懸液。
5.2培養(yǎng)將上述混懸液吸取5ml，接種于50ml工葡萄糖肉浸液肉湯，或直接劃線接種于血平板。如檢樣污染嚴重，可同時按上述量接種匹克氏肉湯，經(jīng)36℃ 土l℃ 培養(yǎng)24h接種血平板，置36℃ 士1℃ 培養(yǎng)24h,挑起乙型血圓形突起的細小菌落，在血平板上分純，然后觀察溶血情況及革蘭氏染色，并進行鏈激酶試驗及桿菌膚敏感試驗。
5.3形態(tài)與染色本菌里球形或卵圓形，直徑0.5um ——1um鏈排列，鏈長短不一，頰者4個～8個細胞組成，長者20個一30個，鏈的長短常與細菌的種類及生長環(huán)境有關(guān)；液體培養(yǎng)中易呈長鏈；在固體培養(yǎng)基中常呈短鏈，不形成芽抱，無鞭毛，不能運動。
5.4培養(yǎng)特性該菌營養(yǎng)要求較高，在普通培養(yǎng)纂上生長不良，在加有血液、血清培養(yǎng)荃中生長較好。溶血性鏈球菌在血清肉湯中生長時管底呈絮狀或顆粒狀沉淀。血平板上菌落為灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直徑約0.5mm～0.75mm，為圓形突起的細小菌落，乙型溶血鏈球菌周圍有2mm—4mm。界限分明、無色透明的溶血圈。
5.5鏈激酶試驗致病性乙型溶血性鏈球菌能產(chǎn)生鏈激酶（即溶纖維蛋白酶），此酶能激活正常人體血液中的血漿蛋白酶原，使成血漿蛋白酶，而后溶解纖維蛋白。吸取草酸鉀血漿0.2ml，加0.8ml滅菌生理鹽水，混勻，再加人18h～24卜、36℃ 士1℃ 培的鏈球菌培養(yǎng)物0.5 m及0.25％氯化鈣0.25ml（如氯化鈣已潮解，可適當(dāng)加大至0.3%——0.35 %)振蕩搖勻，置于36℃ 士1℃ 水中10min，血漿混合物自行凝固（凝固程度至試管倒置，內(nèi)容物不流動），然后觀察凝固塊重新完全溶解的時間，完全溶解為陽性，如24h后不溶解即為陰性。
草酸鉀人血漿配制：草酸鉀0.01g放人滅菌小試管中，再加人5ml血，混勻，經(jīng)離心沉淀，吸取上清液即為草酸鉀人血漿。
5.6桿菌肚敏感試驗挑取乙型溶血性鏈球菌液，涂布子血平板上，用滅菌鑷子夾取每片含有。．04單位的桿菌膚紙片，放于上述平板上，于36℃ 士1℃ 培養(yǎng)18h—24h，如有抑菌帶出現(xiàn)即為陽性，同時用已知陽性菌株作為對照。