質(zhì)粒抽提的原理及操作步驟
質(zhì)粒抽提方法即去除 RNA，將質(zhì)粒與細菌基因組 DNA分開，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，以得到相對純凈的質(zhì)粒。今天我們主要來了解一下質(zhì)粒抽提原理和操作步驟。
⒈質(zhì)粒抽提原理
其中用到三種溶液以及硅酸纖維膜（超濾柱）。 溶液Ⅰ：50 mM葡萄糖 / 25 mMTris-HCl/ 10 mMEDTA，pH 8.0；溶液Ⅱ：0.2 N NaOH / 1%SDS； 溶液Ⅲ：3 M 醋酸鉀/ 2 M 醋酸/75%酒精。
溶液Ⅰ
葡萄糖是使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部；EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，其主要目的是為了螯合二價金屬離子從而達到抑制DNase的活性；可添加RNase A消化RNA。
溶液Ⅱ
此步為堿處理。其中NaOH主要是為了溶解細胞，釋放DNA，因為在強堿性的情況下，細胞膜發(fā)生了從雙層膜結(jié)構(gòu)向微囊結(jié)構(gòu)的變化。SDS與NaOH聯(lián)用，其目的是為了增強NaOH的強堿性，同時SDS作為陰離子表面活性劑破壞脂雙層膜。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷也會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA會斷裂。
溶液Ⅲ
溶液III的作用是沉淀蛋白和中和反應(yīng)。其中醋酸鉀是為了使鉀離子置換SDS中的鈉離子而形成了PDS，因為十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶水的，同時一個SDS分子平均結(jié)合兩個氨基酸，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了。2 M的醋酸是為了中和NaOH�；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50－100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被 PDS共沉淀了，所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。75%酒精主要是為了清洗鹽份和抑制Dnase；同時溶液III的強酸性也是為了使DNA更好地結(jié)合在硅酸纖維膜上
⒉質(zhì)粒抽提步驟
⑴使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒時請參考具體試劑盒的操作說明。如Omega公司的E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit I, Q(capless) Spin （質(zhì)粒提取盒）。
⑵堿裂解手提法：此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴增、銀染序列分析。方法如下：
①接1%含質(zhì)粒的大腸桿菌細胞于2mlLB培養(yǎng)基。
②37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
③取1.5ml菌體于Ep管(離心管)，以4000rpm離心3min，棄上清液。
④加0.lml溶液I（1%葡萄糖，50mM/LEDTApH8.0，25mM/LTris-HClpH8.0）充分混合。
⑤加入0.2ml溶液II（0.2mM/LNaOH，1%SDS），輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5min.
⑥加入0.15m1預(yù)冷溶液III（5mol/LKAc，pH4.8），輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5min.
⑦以10，000rpm離心20min，取上清液于另一新Ep管。
⑧加入等體積的異戊醇，混勻后靜置10min.
⑨以10，000rpm離心20min，棄上清。
⑩用70%乙醇0.5ml洗滌一次，抽干所有液體。
⑪待沉淀干燥后，溶于50ulTE緩沖液中（或60℃溫育去離子水）。
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