“無名英雄”癲狂模式啟動，摧毀你的皮膚屏障—KLHL24基因突變

生活中總能聽到平民英雄的傳說，其實在生物體內(nèi)，也有著眾多無名英雄為了維護我們身體的健康無時無刻不在默默無聞的工作著。KLHL24就是其中之一。

導語

常態(tài)下，生為泛素連接酶的KLHL24，一面引領著獵物-KRT14一步不回頭地邁向深淵（蛋白酶體），一面又為維護人類的皮膚屏障不惜自行了斷（自泛素化）。可惜世事無常，基因突變（Klhl24-∆N28）你能奈其所何？缺失了N端28個氨基酸的Klhl24仿佛進入癲狂，自律性的自我毀滅程序不再，無休止的消滅獵物才是終極目標，給原本立誓要保護的細胞和組織，造成毀滅性的打擊。

   大皰表皮松解癥(epidermolysis bullosa，EB)是一種皮膚疾病，常見表現(xiàn)癥狀為皮膚在受到輕微摩擦或碰撞后出現(xiàn)水皰及血皰、糜爛， 好發(fā)于肢端及四肢關(guān)節(jié)伸側(cè)，嚴重者可累及機體任何部位。其中遺傳性EB的主要發(fā)病類型為單純性EB（simplex EB，EBS），皮損最表淺，愈后一般不留瘢痕。皮膚結(jié)構(gòu)性蛋白的損傷（如角蛋白）會造成皮膚脆弱，引發(fā)EB.

   本文作者通過對EBS患者的基因突變分析為切入點，一步步解釋了KLHL24顯性突變?nèi)绾我�起EB的發(fā)生。

罪魁禍首-基因突變

   通過對不同EB患者基因進行全外顯子組測序，發(fā)現(xiàn)均出現(xiàn)KLHL24基因突變(Fig. 1a)。通過RT-PCR，證明KLHL24在人體各組織中廣泛表達，包括皮膚 (Fig. 1b).

KLHL24屬于Kelch-like 基因家族，該基因家族編碼的蛋白具有一個高度保守的BTB結(jié)構(gòu)域和BACK結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域可與CUL3和RBX1互作形成CUL3–RBX1–Kelch泛素連接酶復合物。 Kelch-like蛋白還具有一個Kelch結(jié)構(gòu)域，用于招募底物，決定了E3連接酶的特異性。

   KLHL24突變位于起始密碼子區(qū)域，因而翻譯無法正常起始，猜測Met29可能作為另一翻譯起始位點。將攜帶正常KLHL24與KLHL24-∆N28質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染細胞分別裂解進行免疫印跡，均發(fā)現(xiàn)目的蛋白的對應條帶(KLHL24-∆N28; Fig. 1c)。

   進一步驗證KLHL24-∆N28翻譯起始位點，在Met1突變情況下（ATA）將Met29密碼子突變（ATG-ATA），最終發(fā)現(xiàn)KLHL24的表達受到抑制(Fig. 1d)，因此證明了Met29可以作為另一翻譯起始位點。

Fig.1 KLHL24 start-codon mutations identified in the five patients result in an N-terminally truncated protein.(a) Sequence chromatograms showing heterozygous c.1A>G (patients 1, 2 and 5), c.3G>T (patient 3) and c.3G>A (patient 4) mutations, affecting the start codon.(b) Expression profile of human KLHL24 determined by RT–PCR, showing ubiquitous expression in representative adult tissues, including skin. (c) Expression of KLHL24 protein analyzed by immunoblotting in 293T cells transfected with the indicated constructs. (d) Expression of KLHL24 proteins analyzed by immunoblotting in 293T cells transfected with the indicated C-terminally GFP-tagged constructs and untransfected cells (–). 

  將KLHL24與KLHL24-∆N28在HaCaT（永生化人類角質(zhì)細胞系）細胞中過量表達，發(fā)現(xiàn)KLHL24-∆N28的表達量遠遠高于正常型KLHL24 (Fig. 2a). 猜測可能是由于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性不同導致，因為mRNA水平與這種蛋白表達量的差異表現(xiàn)無關(guān)( Fig. 3)。

Fig 2. (a) Stably expressed KLHL24-N28 shows markedly higher protein levels than the wild-type protein. MG-132 treatment for 8h increases the protein levels of KLHL24 but not those of KLHL24-∆N28. (b-c) Measurement of the stability of wild-type  and mutant  KLHL24-∆N28 proteins by cycloheximide (CHX) chase assays.

Fig 3.  Proteasome inhibitor MG132 treatment increased did not change the mRNA levels of  KLHL24 in HaCaT cells stably expressing KLHL24 or KLHL-ΔN28. The mRNA levels were normalized to the mRNA level of KLHL24 in HaCaT cells expressing  KLHL24 not treated by MG132

   既然推測這種表達量差異與蛋白穩(wěn)定性相關(guān)，如果加入蛋白酶抑制劑，結(jié)果會如何？

    在蛋白酶抑制劑MG-132作用下，KLHL24的豐量大大提升，但KLHL24-∆N28并無明顯變化(Fig. 2a)，同時，突變型KLHL24-∆N28 半衰期(t1/2 = ~4.6 h)經(jīng)測定也遠超正常型KLHL24 (t1/2 = ~0.4 h)  (Fig. 2b,c）, 說明KLHL24-∆N28性質(zhì)較野生型更穩(wěn)定。

   說也奇怪，明明少了一截，人生卻像開了掛直接升級金剛不壞之身？這是何故？

    結(jié)合以往研究，多數(shù)E3連接酶都會受到自泛素化調(diào)節(jié)，因此推測突變型與正常型KLHL24的穩(wěn)定性差異可能也與自泛素化過程相關(guān)。

• 在表達CUL3, RBX1和 KLHL24的293T/ HaCaT轉(zhuǎn)染細胞中，檢測KLHL24的泛素化水平，發(fā)現(xiàn)KLHL24-∆N28較正常KLHL24泛素化水平低；

• MLN4924通過抑制泛素化修飾可以提高KLHL24的豐量而突變型卻保持不變。

• 免疫共沉淀實驗表明，KLHL24和 KLHL24-∆N28與CUL3的結(jié)合能力相近，排除了KLHL24-∆N28穩(wěn)定性增強是由于失去與CUL3 結(jié)合能力的可能性。

• Kelch-like蛋白的二聚化影響其泛素化能力， 而GST和免疫共沉淀實驗均表明，KLHL24-∆N28二聚化能力不受影響。

   所有結(jié)果表明，突變體KLHL24-∆N28失去了自泛素化能力，從而提高了蛋白的穩(wěn)定性及存在豐量。

   說到底，身為泛素連接酶，指引底物奔赴黃泉也是職責所在�？捎H密接觸的時間這么短，怎么才能從“蕓蕓眾生”中確認那個對的TA呢？

第一步：確認候選底物

   單獨表達KLHL24  Kelch結(jié)構(gòu)域（Kelch結(jié)構(gòu)域負責與底物結(jié)合）與GST融合蛋白，同時，為排除非特異性結(jié)合蛋白，以Kelch結(jié)構(gòu)域突變體(Kelchmut)作為平行對照。將HaCaT細胞裂解液依次進行GST pulldown及質(zhì)譜，確認了部分候選底物，初步質(zhì)譜分析（Fig. 4c）表明，KRT14一枝獨秀，很可能是KLHL24的底物。

    進一步與對照組對比分析，最終發(fā)現(xiàn)KRT14可與KLHL24,KLHL24-∆N28結(jié)合（Fig. 4c,d,e）,而Kelchmut與KRT14的親和力明顯較低。

Fig4.(c) PSM (peptide spectrum match) score ratios for the proteins identified by mass spectrometry. (d) GST pulldown experiments indicate that GST-Kelch interacts with HA-KRT14. The two GST blots were cropped from the full-length blot shown in supplementary Figure 9c. (e) Coimmunoprecipitation experiments in HaCaT cells indicate that KRT14 interacts with KLHL24 and KLHL24-∆N28. (f) Immunofluorescent staining shows markedly reduced KRT14 levels in the basal keratinocytes of skin from patient 5 in contrast to normal skin.(g) Immunoblotting of skin samples shows a marked reduction in the amount of KRT14 in patient 5 in comparison to normal controls.

第二步：驗證底物

• 首先測定KRT14蛋白含量，結(jié)果表明2位患者皮膚樣品中的KRT14含量明顯低于年齡相當?shù)姆腔疾�對照組(Fig. 4f,g)。同時，與KRT14形成異二聚體的Keratin 5 (KRT5)含量也較對照組低，但keratin 1 (KRT1)含量沒有發(fā)生變化（不與KRT14或 KRT5形成二聚體）。

• 角蛋白免疫熒光及皮膚分化標志物表明，患者基底層細胞中角蛋白大量減少，但基底上層角蛋白及分化標志物豐度保持不變(Fig.5)

Figure 5. IF staining of pan-keratin, KRT1, keratin10 (KRT10) and loricrin on skin sections of Patient 5 and a normal control. 

• HaCaT細胞中過表達KLHL24，會小幅度降低KRT14蛋白水平，而KLHL24-∆N28的過表達會使KRT14含量急劇降低(“input”in Fig.4e)；半衰期檢測結(jié)果表明，KLHL24和KLHL24-∆N28過表達會使KRT14穩(wěn)定性降低。

• RNAi表明KLHL24下調(diào)會提升KRT14蛋白存在水平，而對于KLHL24-∆N28， 當siRNA靶點位于編碼區(qū)時可以提高KRT14含量，位于5'或3'UTR區(qū)域時則無明顯變化。

• 進一步檢測293T細胞中KRT14泛素化水平，觀察到KLHL24 或KLHL24-∆N28瞬時表達后與CUL3 和RBX1結(jié)合可提高KRT14的泛素化水平。

   綜合以上基因分析及生化實驗結(jié)果可知，KLHL24可作為E3泛素連接酶作用于底物KRT14，其功能獲得性突變體KLHL24-∆N28會導致底物KRT14的過度降解使皮膚完整性受損。

                                             

   OK，現(xiàn)在我們知道了，患者之所以發(fā)生皮損，原來是角蛋白KRT14非正常大量降解所致，而這背后真正的魔手，歸結(jié)于KLHL24突變。

   既然KLHL24這么重要，追本溯源，那么它會不會也參與角朊細胞的分化過程呢？

   為了研究KLHL24在皮膚分化中的調(diào)節(jié)作用，作者使用鈣開關(guān)誘導小鼠角朊細胞分化模型。研究發(fā)現(xiàn)：

• Klhl24編碼的mRNA在分化過程中大幅提高，在一定程度上與角質(zhì)細胞的分化標志物Lor， Krt10相近.

• Krt14蛋白含量隨分化大幅降低，而其mRNA水平卻出現(xiàn)小幅度上升，表明在此過程中出現(xiàn)了蛋白降解。

• 據(jù)以往研究報道，Klhl24的表達可能會有轉(zhuǎn)錄因子p73的參與，而p73隨著角質(zhì)細胞的分化也會出現(xiàn)表達上調(diào)。

• 通過FISH，發(fā)現(xiàn)在正常和病人來源的皮膚樣本中，基底層角質(zhì)細胞較基底上層角質(zhì)細胞的KLHL24表達量更低，而KRT14的含量則與此相反(Fig. 6)。

Figure 6. KLHL24 mRNA FISH experiment in skin samples of Patient 5: KLHL24 mRNA FISH (Magenta), KRT14 IF (Green). Arrows: upper periphery of the basal layer. Dot plot: quantification of the FISH intensity of the keratinocytes’ cytoplasmic area with positive or negative KRT14 staining respectively.

   綜上，表明在角朊細胞分化過程中， KLHL24表達上調(diào)并扮演了清除KRT14的角色。

   體外研究告一段落，也是時候上活體小鼠模型了。

  利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建雜合子(Klhl24^c.3G/T)及純合子(Klhl24^-/-)基因編輯小鼠（Fig.7d）（此模型小鼠由百奧賽圖供應， 可以榮登Nature期刊也是榮幸之至，榮幸之至啊）

形態(tài)學方面：

Klhl24^c.3G/T小鼠與野生型同窩鼠仔相比，呈現(xiàn)出更明顯的與年齡相關(guān)的脫發(fā)，減重及體型小癥狀（Fig.7e），但是Klhl24^-/-卻表型正常。雜合子(Klhl24^c.3G/T)及純合子(Klhl24^-/-)小鼠均沒有表現(xiàn)出皮膚脆性。

蛋白表達方面：

提取Klhl24^c.3G/T ，Klhl24^-/- mice及野生型小鼠皮膚和大腦組織進行免疫共沉淀，免疫印記實驗。發(fā)現(xiàn)皮膚組織中并無任何條帶，大腦組織中則在Klhl24^c.3G/T中檢測到Klhl24-∆N28條帶（Fig.7f）。這些結(jié)果和Human Protein Atlas的研究發(fā)現(xiàn)相符，即Klhl24在大腦組織中的表達量高于皮膚組織。

Fig7. (d) Illustration of the CRISPR/Cas9-mediated knock-in and knockout strategies. (e) Photograph of a 20-weekold Klhl24c.3G/T male mouse (left) and its wild-type male littermate (right). (f) Cerebral tissue extracts from a Klhl24c.3G/T mouse, its wild-type littermate and a Klhl24-/- mouse were immunoprecipitated with an antibody to KLHL24 followed by immunoblotting. 

   同時，Klhl24^c.3G/T小鼠皮膚樣本中，Krt14含量較野生型降低(Fig. 7g–i)，降低程度顯著但仍高于患者皮膚Krt14含量，此現(xiàn)象在一定程度上解釋了Klhl24^c.3G/T小鼠為何沒有皮膚脆性表型。

Fig7. (g) Immunoblotting using skin extracts shows a reduction in Krt14 protein levels in Klhl24c.3G/T mice in comparison to a wild-type littermate. (h) Quantification of the relative intensity of the Krt14 bands for Klhl24c.3G/T mice (n = 5) and their wild-type littermates (n = 11) from five independent experiments.(i) Immunofluorescence of Krt14 in skin sections from a Klhl24c.3G/T mouse and its wild-type littermate.

劃重點

• KLHL24可以作為E3泛素連接酶對底物KRT14進行泛素化修飾，并發(fā)現(xiàn)其獲得性功能突變體可以導致KRT14的大幅度降低并引發(fā)人類的皮膚脆性病癥（Fig.8）

Figure 8. Schematic of the disease-causing mechanism of KLHL24 mutations. (a) Under normal condition, KLHL24 protein is tightly controlled by autoubiquitination and turnover of KRT14 by CUL3–RBX1–KLHL24 is at a low level. (b) In the EBS cases we found, KLHL24-∆N28 is stabilized through abolished autoubiquitination. Overstabilized mutant KLHL24 leads to excessive ubiquitination and degradation of KRT14. 

• 角朊細胞分化時， KLHL24的誘導表達及其對KRT14的泛素化修飾可能參與其中，而KLHL24的自泛素化可以防止KRT14的過度下降，從而提供了一層安全保障。

• 在EB的疾病表型方面，人類和相應的小鼠模型會存在一定差異；在我們的研究中，KLHL24起始密碼子突變會導致KRT14含量不同程度的降低，以及在人和小鼠中不同的皮膚疾病表型，至于為何會出現(xiàn)這種差異，還有待進一步研究。

  結(jié)語

    失去了N端28個氨基酸，就可以導致KLHL24性情大變瘋狂降解皮膚結(jié)構(gòu)性蛋白KRT14，進而引發(fā)人體皮膚病變。所以，接下來，怎么對癥下藥，怎么研究E3泛素連接酶家族其他成員，是不是又有一點點思路了呢？這里小編就不多說啦，大家有興趣可以自行查閱文獻哦~

參考文獻：

Feng, C., Lin, Z., Li, S., Wang, H., Yang, Y., & Tan, X. (2017). 474 Stabilizing mutations of KLHL24 ubiquitin ligase cause loss of keratin 14 and human skin fragility. Journal of Investigative Dermatology, 137(5), S82.

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