小鼠模型助力探究免疫檢查點(diǎn)阻斷療法依賴于干細(xì)胞樣TIL亞群的增殖

在與病毒或癌癥的長(zhǎng)期對(duì)抗中，精疲力竭的T細(xì)胞會(huì)逐漸喪失功能，這種狀態(tài)被稱為T細(xì)胞耗竭。在當(dāng)今大熱的免疫治療中，檢查點(diǎn)阻斷會(huì)促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8⁺ T淋巴細(xì)胞的增殖。不過，這種現(xiàn)象背后的機(jī)理仍不清楚。

瑞士洛桑大學(xué)Werner Held領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)近日鑒定出腫瘤內(nèi)Tcf1⁺PD-1⁺CD8⁺ T細(xì)胞，這些細(xì)胞表現(xiàn)出干細(xì)胞樣特征，并響應(yīng)治療性疫苗接種和免疫檢查點(diǎn)阻斷免疫療法，促進(jìn)腫瘤控制。

這篇題為“Intratumoral Tcf1⁺PD-1⁺CD8⁺ T Cells with Stem-like Properties Promote Tumor Control in Response to Vaccination and Checkpoint Blockade Immunotherapy”的文章于1月15日發(fā)表在《Immunity》雜志上。
 

檢查點(diǎn)阻斷介導(dǎo)了腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8⁺ T淋巴細(xì)胞（TIL）的增殖反應(yīng)。這種反應(yīng)的來源仍不清楚，因?yàn)槁�性活化促進(jìn)了T細(xì)胞的終末分化，也就是T細(xì)胞耗竭。研究人員此次鑒定出腫瘤反應(yīng)性TIL的亞群，它們表現(xiàn)出耗竭細(xì)胞和中樞記憶細(xì)胞的標(biāo)志，也就是表達(dá)檢查點(diǎn)蛋白PD-1和轉(zhuǎn)錄因子Tcf1。

他們發(fā)現(xiàn)，Tcf1⁺PD-1⁺ TIL介導(dǎo)了免疫治療時(shí)的增殖反應(yīng)，產(chǎn)生了Tcf1⁺PD-1⁺細(xì)胞和分化的Tcf1⁻PD-1⁺細(xì)胞。Tcf1⁺PD-1⁺ TIL的消融限制了對(duì)免疫治療的響應(yīng)。Tcf1不是產(chǎn)生Tcf1⁺PD-1⁺ TIL所必需的，但對(duì)于維持這些細(xì)胞的干細(xì)胞樣功能是必需的。

他們?cè)诤谏�素瘤患者血液的腫瘤反應(yīng)性CD8⁺ T細(xì)胞和原發(fā)性黑色素瘤的TIL中檢測(cè)到人Tcf1⁺PD-1⁺細(xì)胞。因此，免疫檢查點(diǎn)的阻斷不依賴于T細(xì)胞耗竭程序的逆轉(zhuǎn)，而是依賴于干細(xì)胞樣TIL亞群的增殖。

背景
CD8⁺ T細(xì)胞在某些腫瘤中的浸潤(rùn)程度可以預(yù)測(cè)患者的總生存率，表明淋巴細(xì)胞可限制腫瘤生長(zhǎng)。盡管如此，大多數(shù)浸潤(rùn)的腫瘤仍有進(jìn)展，表明這種自發(fā)的抗腫瘤免疫反應(yīng)通常不足以控制腫瘤。免疫治療旨在增強(qiáng)抗腫瘤的免疫應(yīng)答，以誘導(dǎo)持久的腫瘤控制。目前的方法包括過繼性T細(xì)胞治療以及抑制性受體（免疫檢查點(diǎn)）的阻斷。

在與病毒或腫瘤的長(zhǎng)期對(duì)抗中，T細(xì)胞的功能會(huì)逐漸喪失（稱為T細(xì)胞耗竭）。它們失去效應(yīng)功能，并誘導(dǎo)T細(xì)胞功能的負(fù)向調(diào)節(jié)劑PD-1。通常這種耗竭的表型被認(rèn)為是終末分化的細(xì)胞，它們喪失擴(kuò)增能力，且壽命短暫。然而，阻斷PD-1后腫瘤內(nèi)CD8⁺ T細(xì)胞出現(xiàn)增殖，這與終末分化的概念存在矛盾。

為此，研究人員想了解自發(fā)或免疫治療引起的抗腫瘤CD8⁺ T細(xì)胞反應(yīng)是否涉及到記憶性CD8⁺ T細(xì)胞組分，如果是這樣，這些細(xì)胞是否屬于腫瘤微環(huán)境的一部分。

Tcf1的缺乏削弱了腫瘤控制
為了確定CD8⁺ T細(xì)胞對(duì)腫瘤的反應(yīng)是否涉及到記憶成分，研究人員檢測(cè)了這些反應(yīng)是否依賴轉(zhuǎn)錄因子Tcf1，它對(duì)中樞記憶性CD8+ T細(xì)胞的形成和功能至關(guān)重要。他們將野生型WT或Tcf7^-/- CD8⁺ T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移到幼稚C57BL/6（B6）小鼠中。一天后，在這種P14嵌合體小鼠皮下植入表達(dá)LCMV gp33的B16黑色素瘤細(xì)胞。這種方法可用來追蹤腫瘤特異性的CD8⁺ T細(xì)胞，并確定這些細(xì)胞及其亞群是否與腫瘤控制有關(guān)。

在腫瘤可觸摸時(shí)，他們利用gp33肽來免疫小鼠。疫苗接種以及WT或Tcf7^-/- P14細(xì)胞的組合導(dǎo)致腫瘤大約在一周后短暫消退。他們發(fā)現(xiàn)，與WT P14細(xì)胞相比，Tcf7^-/- P14細(xì)胞的保護(hù)作用是短暫的。在治療終點(diǎn)時(shí)，WT中腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8⁺ T淋巴細(xì)胞的豐度比Tcf7^-/- P14高10倍。因此，缺乏Tcf7的P14 TIL在疫苗接種早期豐度高，但隨后下降，這與腫瘤控制的減少存在關(guān)聯(lián)。
 

腫瘤特異性TIL包含大量Tcf1⁺PD-1⁺ 和Tcf1^-PD-1⁺ CD8⁺ T細(xì)胞
由于延長(zhǎng)的腫瘤控制依賴于Tcf1，研究人員接著鑒定接種疫苗和未治療的小鼠中WT P14細(xì)胞中Tcf1的表達(dá)。幼稚P14細(xì)胞表現(xiàn)為均勻的Tcf1⁺。類似地，當(dāng)未治療小鼠出現(xiàn)可觸摸的腫瘤時(shí)，大部分P14 TIL為Tcf1⁺，但也表達(dá)PD-1。當(dāng)腫瘤中等大小時(shí)，Tcf1⁺PD-1⁺ P14 TIL的豐度增加8倍，但當(dāng)腫瘤增大至1 cm³時(shí)，其豐度下降。

他們?yōu)槌霈F(xiàn)腫瘤的小鼠上接種治療性疫苗，一周后，Tcf1⁺PD-1⁺ P14 TIL強(qiáng)烈擴(kuò)增（176倍），并且這些細(xì)胞在終點(diǎn)時(shí)仍然以很高的數(shù)量存在。P14 TIL還包含相當(dāng)量的Tcf1^-PD-1⁺亞群，它們與Tcf1⁺PD-1⁺ TIL平行擴(kuò)增和減少。通過GFP標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，他們還發(fā)現(xiàn)Tcf1⁺PD-1⁺ TIL組成型地存在于腫瘤中。隨著腫瘤進(jìn)展，它們的豐度瞬時(shí)增加，并且通過治療性疫苗接種而進(jìn)一步擴(kuò)增。

Tcf1⁺CD8⁺ T細(xì)胞在腫瘤控制中的作用
為了評(píng)估腫瘤特異性Tcf1⁺CD8⁺ T細(xì)胞在免疫應(yīng)答和腫瘤控制中的重要性，研究人員委托賽業(yè)生物（Cyagen）生成了一種小鼠品系，允許在體內(nèi)選擇性消融表達(dá)Tcf1的細(xì)胞。他們將白喉毒素受體（DTR）T2A GFP融合基因插入含有Tcf7基因座的BAC中，制備出Tcf7^DTR-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠。接著，他們生成了Tcf7^DTR-GFP P14嵌合體小鼠，并植入B16-gp33腫瘤細(xì)胞。白喉毒素（DT）處理能夠有效去除GFP⁺ P14 TIL，但對(duì)GFP^- P14 TIL的豐度無影響。

他們之后用DT處理荷瘤小鼠，并再次免疫接種。DT暴露使得表達(dá)GFP或Tcf1蛋白的P14細(xì)胞幾乎消失，而Tcf1^- P14細(xì)胞的豐度也降低。這表明Tcf1⁺細(xì)胞維持了Tcf1^- TIL的產(chǎn)生。Tcf7^DTR-GFP P14嵌合體小鼠在處死時(shí)腫瘤的體積和重量都較低。相比之下，當(dāng)Tcf1⁺ P14細(xì)胞被消融時(shí)腫瘤出現(xiàn)進(jìn)展。這些數(shù)據(jù)表明，腫瘤特異性Tcf1⁺PD-1⁺ CD8⁺ T細(xì)胞是形成抗腫瘤免疫力所必需的。

如此看來，治療性疫苗的接種所帶來的腫瘤控制依賴于腫瘤特異性Tcf1⁺PD-1⁺CD8⁺ T細(xì)胞的存在。之后，研究人員又通過一系列實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了的確是瘤內(nèi)細(xì)胞而不是外周細(xì)胞的貢獻(xiàn)。

對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷療法的響應(yīng)
在動(dòng)物模型和癌癥患者中，共抑制受體（如PD-1和CTLA-4）的阻斷可以介導(dǎo)T細(xì)胞依賴的腫瘤消退。然而，這種治療干預(yù)背后的分子機(jī)制仍不清楚。研究人員猜測(cè)，Tcf1⁺ CD8⁺ T細(xì)胞可能在免疫檢查點(diǎn)阻斷療法中發(fā)揮作用。

他們使用了Tcf7^DTR-GFP P14嵌合體小鼠，利用FTY720來防止新的T細(xì)胞流入腫瘤，并利用白喉毒素（DT）來消融Tcf1⁺ P14 TIL。與對(duì)照小鼠相比，檢查點(diǎn)阻斷療法使Tcf1⁺和Tcf1^- P14 TIL的豐度增加10倍以上。Tcf1⁺ TIL的消除則大大減少了Tcf1^- P14 TIL的豐度。因此，檢查點(diǎn)阻斷擴(kuò)增了腫瘤內(nèi)Tcf1⁺ TIL，而這些細(xì)胞是產(chǎn)生分化的Tcf1^- TIL所必需的。
 

腫瘤內(nèi)Tcf1⁺PD-1⁺CD8⁺ T細(xì)胞具有干細(xì)胞和耗竭細(xì)胞的特征
考慮到Tcf1⁺PD-1⁺ TIL對(duì)于腫瘤控制的重要性，研究人員對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行了分子鑒定。他們通過功能分析發(fā)現(xiàn)，Tcf7^GFP+ TIL具有擴(kuò)增、分化和再生Tcf7^GFP+細(xì)胞的潛力。與這些干細(xì)胞樣特征一致，RNA-seq分析也發(fā)現(xiàn)Tcf7^GFP+ P14 TIL的轉(zhuǎn)錄本與成體干細(xì)胞或造血干細(xì)胞表達(dá)的部分基因顯著重疊。同時(shí)，Tcf7^GFP+ TIL也表達(dá)了多個(gè)耗竭標(biāo)志物（Lag3、Pdcd1、CTLA4），而Tcf7^GFP- TIL還選擇性地表達(dá)了更多的耗竭相關(guān)基因，表明這些基因的表達(dá)與分化相關(guān)。

黑色素瘤患者中存在Tcf1⁺PD-1⁺CD8⁺ T細(xì)胞
之后，研究人員又對(duì)黑色素瘤患者的外周血CD8⁺ T細(xì)胞以及原發(fā)性黑色素瘤進(jìn)行分析，的確檢測(cè)到Tcf1⁺PD-1⁺CD8⁺細(xì)胞。單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)表明，人黑色素瘤含有TCF7⁺PDCD1⁺CD8A⁺ TIL，其基因表達(dá)譜與小鼠模型中鑒定出的細(xì)胞相似。通過TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的薈萃分析，他們認(rèn)為TCF7/PDCD1特征與患者生存率的改善相關(guān)。

研究人員認(rèn)為，這項(xiàng)研究揭示了共表達(dá)Tcf1和PD-1的腫瘤內(nèi)CD8⁺ T細(xì)胞在免疫治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究結(jié)果有助于人們了解免疫干預(yù)如何影響抗腫瘤的免疫應(yīng)答。這些干細(xì)胞樣細(xì)胞的鑒定有望進(jìn)一步改善所有類型的癌癥免疫治療。

原文檢索
Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T Cells with Stem-like Properties Promote Tumor Control in Response to Vaccination and Checkpoint Blockade Immunotherapy
DOI: https://doi.org/10.1016/j.immuni.2018.12.021