非培養(yǎng)檢測技術(shù)在曲霉菌感染中的臨床應(yīng)用進(jìn)展

         中國微生物菌種查詢網(wǎng) 曲霉菌在環(huán)境中廣泛存在，主要通過呼吸道吸入霉菌胞子進(jìn)入人體。首先侵人感染肺部進(jìn)而發(fā)肺曲霉菌病。在血液系統(tǒng)疾病、肺結(jié)核、慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、肺癌等免疫抑制患者中曲霉已成為僅次于白色念珠菌的重要致病真菌。曲霉菌感染已成為最常見的、傳播最廣的條件致病霉菌之一，但早期診斷困難，常常導(dǎo)致治療時機(jī)延誤，病死率高達(dá)30％一50％ 。
傳統(tǒng)的真菌分離、培養(yǎng)和組織病理鑒定等診斷方法敏感性低、陽性率低。早期、快速、簡便、敏感、特異的診斷方法是目前條件性曲霉菌感染實(shí)驗(yàn)診斷研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。近年來，國內(nèi)外相繼建立了一系列非培養(yǎng)的檢測技術(shù)，現(xiàn)綜述如下：
一、特異性抗原的檢測
   1 半乳甘露聚糖(Galactomannan，GM>是存在于曲霉和青霉細(xì)胞壁中的一類具有高度特異性和高度保守性的多糖，可作為曲霉菌檢測的特異性分子的標(biāo)志物�；�本化學(xué)結(jié)構(gòu)為B一(1，4)．苷鏈連接成的D一吡喃甘露糖為主鏈，以(It一(1，6)-苷鏈連接成的D-吡喃半乳糖構(gòu)成為支鏈。每個GM上有十幾個這樣的半乳糖表位可被抗GM的單克隆抗體EB—A：識別。當(dāng)曲霉菌吸入進(jìn)入人體肺組織中吞噬細(xì)胞便快速將它吞噬，消化處理后釋放出真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分。通過血清、支氣管肺泡灌洗液、尿液、腦脊液均可監(jiān)測到半乳甘露聚糖。其檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和乳膠凝集試驗(yàn)(LA)等，最低檢測限度為5—10 pg／mL。其中LA和ELISA 已經(jīng)商品化應(yīng)用較廣泛。Kauffmann—Lacroix等 比較LA、ELISA、直接鏡檢和組織活檢各方法在診斷真菌性鼻竇炎的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值，發(fā)現(xiàn)直接鏡檢法檢測敏感性低，影響臨床及時的診斷與治療，組織活檢敏感性高，但臨床很難廣泛開展。Acosta 報(bào)道GM陽性結(jié)果較曲霉菌培養(yǎng)早4．3天。2003年美國FDAGM檢測批準(zhǔn)血GM監(jiān)測用于血液、腫瘤等免疫低下者侵襲性曲霉感染的診斷指標(biāo) J。對高�；颊呙恐�2次連續(xù)動態(tài)監(jiān)測具有早期診斷價(jià)值。臨床常用試劑為美國platelia Aspergillus(Bio—Rad)GM ELISA，用ELISA(EB一2單抗，雙夾心法)的方法檢測GM(EBA一2單抗)。國內(nèi)外研究多采用同樣的試劑和方法，但報(bào)道的判定界值尚不統(tǒng)一，主要原因是待檢人群不同，實(shí)驗(yàn)條件限制以及采樣頻率等有關(guān) 。Fujiuchi S 在2001—2008年研究了1511肺部慢性疾病包括肺結(jié)核、COPD、肺間質(zhì)纖維化等肺部慢性疾病患者，當(dāng)GM>0．5時，敏感性63．4％ ，特異性68．6％ ；當(dāng)GM>0．51時，特異性更高；美國FDA判定血
GM>0．5為陽性，歐盟判定I>0．51為陽性。目前歐美專家一致認(rèn)為兩次，GM>0．5可判定陽性 J。除了血液標(biāo)本支氣管肺泡灌洗液檢測GM是研究熱點(diǎn)，Park SY 報(bào)道了肺泡灌洗液GM包括359例患者，當(dāng)BAL—GM≥0．5時其敏感性達(dá)64％ ，特異性89％ 。國外He H等 提出血聯(lián)合BALF檢測GM可提高IPA早期的診斷率，需要進(jìn)一步研究證明。
   GM檢測對診斷曲霉菌感染有臨床意義，但少數(shù)情況下它可出現(xiàn)假陽性、假陰性。假陽性與進(jìn)食牛奶、應(yīng)用青霉素如哌拉西林／他唑巴坦等有關(guān)。新生隱球菌的莢膜含有與GM呈交叉反應(yīng)的表位，可出現(xiàn)假陽性。另外棘白菌素類抗真菌藥物的作用靶點(diǎn)為破壞真菌的細(xì)胞壁，因此在使用該類藥物后同樣出現(xiàn)假陽性。假陰性與抗真菌治療、病灶局部被纖維組織包裹未侵入血、組織液或與血液中的多種物質(zhì)結(jié)合后使其抗原表位被封閉、體內(nèi)產(chǎn)生高滴度GM抗體有關(guān)。
   2 1，3一B．D葡聚糖抗原(G試驗(yàn)) 除結(jié)合菌和隱球菌除外的所有真菌的一種特異性的細(xì)胞壁成分，監(jiān)測標(biāo)本為血清，其敏感性和特異性均達(dá)到80％ 。此項(xiàng)檢測被美國FDA和歐洲許多國家批準(zhǔn)用于血液、腫瘤等免疫受損者中。因?qū)Χㄖ驳哪钪榫�顯示陰性 l 常與GM聯(lián)合監(jiān)測進(jìn)而提高曲霉菌感染診斷的敏感性，BG和GM均陰性基本可排除真菌感染。但血清學(xué)BDG檢測容易受到血液學(xué)及其他因素影響如纖維素類物質(zhì)：手術(shù)中使用的紗布、海棉、血液透析中的纖維素膜、靜脈應(yīng)用免疫球蛋白和白蛋白等。而且其在血液中可與抗體形成免疫復(fù)合物，并迅速被血液清除，造成假陰性 。
二、特異性抗體的檢測
侵襲性真菌病多為免疫受損宿主，常常缺乏可檢測到的抗體，或者抗體的產(chǎn)生變化較大。國外報(bào)道利用從真菌提取的天然抗原建立了多種地方性真菌病血清學(xué)檢測，包括芽生菌病、球抱子菌病、組織胞漿菌病、副球胞子菌病和毒霉病的早期診斷及流行病學(xué)調(diào)查，并顯示出較高的敏感性和特異性，在某些地方性條件性真菌感染顯示出一定的應(yīng)用價(jià)值 。國內(nèi)外研究曲霉菌特異性抗體均較少，敏感性和特異性較差，早期診斷價(jià)值不大。
三、特異性核酸的檢測
   通過分子生物學(xué)技術(shù)特別是PCR擴(kuò)增可在短時間內(nèi)檢測微量的真菌DNA。臨床標(biāo)本可選擇血液、尿液、BAL、腦脊液及玻璃體液，等。國外Raad等” 用PCR檢測了249例癌癥患者的BAL中曲霉的線粒體和堿性磷酸酶基因，敏感性、特異性及陽性、陰性預(yù)期值分別為80％ 、93％ 、38％和99％ 。Sanguinetti 采用實(shí)時定量PCR法對4J4例IPA患者BAL中幾種睦霉菌(煙曲霉、黃曲霉、灰綠曲霉、黑曲霉和土曲霉)共有的18sRNA編碼基因上一個124bP的保守片段進(jìn)行檢測敏感性90％ ，特異性100％ 。Real—timePCR可以在封閉狀態(tài)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，可避免擴(kuò)增產(chǎn)物污染而引起的假陽性結(jié)果。同時還可以結(jié)合限制性內(nèi)切酶來分析區(qū)別鑒定致病菌的種屬。因此隨著實(shí)時PCR技術(shù)的完善和發(fā)展，通過監(jiān)測曲霉的DNA水平實(shí)施療效監(jiān)控提示預(yù)后，將大大提高PCR用于臨床系統(tǒng)性真菌感染早期診斷的價(jià)值。
四、特異性代謝物的檢測
檢測真菌感染代謝物D一甘露聚醇(mannito1)可用于曲霉菌感染的診斷。國外動物實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道曲霉菌D一甘露醇水平明顯高于非感染對照組 J。而國內(nèi)相關(guān)報(bào)道尚未見明確報(bào)道。由于不同菌株產(chǎn)生代謝物能力差別較大，而且受體內(nèi)代謝物及其他微生物代謝物的干擾，檢測所需的儀器設(shè)備要求較高，目前仍處于科研階段，臨床常規(guī)應(yīng)用受到限制，因此需要更大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。
五、免疫組化
   免疫組織化學(xué)是用標(biāo)記的抗體或抗原對細(xì)胞或組織中的相應(yīng)抗原或抗體進(jìn)行定性、定位或定量檢測，經(jīng)過組織化學(xué)的顯色反應(yīng)舌，顯微鏡進(jìn)行觀察，具有特異性、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，并可將形態(tài)學(xué)和功能代謝密切結(jié)合。國外已有制備出鼠抗煙曲霉單克隆抗體，兔抗新型隱球菌及兔抗白念珠氫多克隆抗體。該方法國內(nèi)外研究尚處于動物試驗(yàn)階段，臨床應(yīng)用未見相關(guān)報(bào)道。
非培養(yǎng)的曲霉菌檢測技術(shù)具有快速、簡便，敏感性、特異性高的優(yōu)點(diǎn)，在診斷曲霉菌感染有重要的價(jià)值，為臨床早期快速診斷侵襲性曲霉菌感染帶來了希望，對及時控制病情、疾病
的預(yù)后具有重要意義。隨著對真菌基因分析和成分的深入研究，以及新的更先進(jìn)檢測技術(shù)的問世，非培養(yǎng)的快速檢測技術(shù)，將成為曲霉菌感染實(shí)驗(yàn)室診斷的重要手段。