蛋白質(zhì)技術(shù)專題：蛋白等電聚焦凝膠電泳技術(shù)（二）
8.常見問題及解釋
1） 若產(chǎn)生模糊條帶則證明聚焦不完全，這可能是由于電泳中的問題或大分子蛋白質(zhì)限制了其在凝膠中的遷移能力。若聚焦時間過長或過短，條帶的分辨率會下降。增加電壓梯度可以使帶形更加銳利。高分子量蛋白質(zhì)在瓊脂糖凝膠中可以聚焦的更好。
2） 產(chǎn)生歪斜的條帶通常由于不正確的pH梯度，檢查電極是否潔凈，是否同凝膠鏈接良好，同時應(yīng)該注意凝膠的邊緣效應(yīng)。
3） 蛋白帶的紋理現(xiàn)象是等電聚焦中經(jīng)常遇到的問題，可能是一下原因：
a，蛋白質(zhì)聚集或沉淀（尤其在等電點(diǎn)附近），或上樣量過大，8M尿素通常用來防止蛋白質(zhì)聚集，去垢劑Triton X－100和NP－40常用來防止膜蛋白的聚集，所以上樣前一定要離心以除去不溶解的顆粒；
b，樣品中殘存核酸，可以采用多種方法去除核酸污染，如酸抽提、鹽沉淀、核酸酶消化等；
c，蛋白質(zhì)修飾，非超純級的尿素中的異氰酸鹽污染物可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氨甲酰化，預(yù)電泳可以去除異氰酸鹽，蛋白質(zhì)樣品處理或儲存不當(dāng)會發(fā)生包括Cys殘基氧化，Asn或Gln殘基去氨基化等修飾過程；
d，波浪形條帶常由于樣品中鹽濃度過高，有時候載體兩性電解質(zhì)或電極液不純或電極不潔凈也會產(chǎn)生波浪形條帶；
e，電極同凝膠連接不平行，配置凝膠時候試劑不純，載體兩性電解質(zhì)濃度過低可導(dǎo)致不均等的pH梯度，若凝膠堿性部分pH梯度丟失，其可能原因是陽極飄移，可以補(bǔ)充pH9－11的載體兩性電解質(zhì)或進(jìn)行非平衡pH梯度電泳；
f，染色時候高背景的產(chǎn)生可能由于固定后載體兩性電解質(zhì)仍殘留于凝膠中，增加1％三氯乙酸的固定時間可解決；
g，蛋白質(zhì)條帶丟失或過淡可能由于蛋白質(zhì)分子量較低（<10kDa〉或蛋白質(zhì)在固定中未被變性，增加三氯乙酸濃度或使用戊二醛固定即可；
h，復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物等電聚焦后可以產(chǎn)生相互重疊的斑點(diǎn)，改變等電聚焦凝膠pH范圍可以解決此問題。進(jìn)一步的蛋白質(zhì)純化或沉淀處理可以避免重疊斑點(diǎn)的產(chǎn)生。
9．其他要注意的事項
1）等電聚焦后可用一根染色的細(xì)線（0.1mm）標(biāo)出染料前沿的位置；
2）不同品牌的載體兩性電解質(zhì)性質(zhì)上有細(xì)微的差別，使用不同來源的載體兩性電解質(zhì)凝膠時候蛋白質(zhì)分離樣式略有差異，若要獲得好的重復(fù)性一般不要更換載體兩性電解質(zhì)的品牌；
3）通常，窄范圍的pH梯度可以提高分辨率，但是需要時間也比較常，pH梯度范圍為2是較好的選擇；
4）由于電源和凝膠冷卻系統(tǒng)的限制，長的凝膠長度為8－10cm，實(shí)際上，分別電泳幾塊不同的pH梯度的凝膠比只電泳一塊較長凝膠效果更好；
5）當(dāng)?shù)入娋劢闺娪緯r間很長時候（>3000V·h），由于載體兩性電解質(zhì)不穩(wěn)定造成的陰極漂移將成為嚴(yán)重問題，陰極漂移會破壞pH梯度，尤其是pH8以上的梯度，為了克服此問題，開發(fā)了一種較短時間（1600V·h）完成等電聚焦電泳的技術(shù)，即非平衡pH梯度電泳，這樣可以在高pH范圍內(nèi)聚焦蛋白質(zhì)，但該方法不能用來測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)。
6）尿素可以促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解，并消除蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)－脂類相互作用，可增加聚焦速度和提高分辨率，同時抑制陰極漂移，但是也要注意變性蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)可能同天然蛋白有所差異。
7）若蛋白溶液中含有SDS，可加入尿素至終濃度8M，在高濃度的尿素下，SDS同蛋白質(zhì)的相互作用極小。
8）在變性液中加入2%Triton X－100以保證蛋白質(zhì)（尤其是膜蛋白）的充分溶解，有些作者推薦使用如CHAPS和Zwittergent3－14等兩性離子去垢劑；
9）超薄凝膠（50-500um）比常用標(biāo)準(zhǔn)等電聚焦更有優(yōu)勢，因?yàn)楦唠妶鰪?qiáng)度和更佳的冷卻效果使聚焦速度更快，分辨率更高。
10）在聚丙烯酰胺等電聚焦凝膠中，高分子量蛋白質(zhì)（>750kd）常常表現(xiàn)異常的遷移行為，瓊脂糖凝膠或瓊脂糖－丙稀酰胺凝膠較適用于高分子量蛋白質(zhì)。
11） 考馬斯亮藍(lán)染色中，三氯乙酸固定后用0.25％SDS的乙醇：醋酸：水（33：10：57）溶液洗滌凝膠10-30min可以進(jìn)一步改善染色效果。SDS同載體兩性電解質(zhì)結(jié)合后可以更好的去除載體兩性電解質(zhì)。
10.固相pH梯度等電聚焦電泳
簡介：固相pH梯度等電聚焦是80年代建立起來的一種等電聚焦技術(shù)，其所用的介質(zhì)是一些具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙稀酰胺衍生物，它們于丙稀酰胺和甲叉雙丙稀酰胺有相似的聚合行為。固定化電解質(zhì)一端的雙鍵可以在聚合中共價結(jié)合到聚丙烯酰胺介質(zhì)中，其另一端的R集團(tuán)為弱酸或弱堿，可在聚合物中形成弱酸或弱堿的緩沖體系，利用緩沖體系滴定終點(diǎn)附近一段pH范圍就可行成近似線性的pH梯度，所以固相pH梯度與載體兩性電解質(zhì)pH梯度的區(qū)別在于前者的分子不是兩性分子，在凝膠聚合時候便形成pH梯度，不隨環(huán)境電場條件的改變而改變，后者是兩性分子，在電場中遷移到自己的等電點(diǎn)后才形成pH梯度。固相pH梯度等電聚焦比傳統(tǒng)等電聚焦具有更高的分辨率，更大的上樣量，其分辨率可達(dá)到0.001pH，是目前分辨率高的電泳方法之一。
1） 若產(chǎn)生模糊條帶則證明聚焦不完全，這可能是由于電泳中的問題或大分子蛋白質(zhì)限制了其在凝膠中的遷移能力。若聚焦時間過長或過短，條帶的分辨率會下降。增加電壓梯度可以使帶形更加銳利。高分子量蛋白質(zhì)在瓊脂糖凝膠中可以聚焦的更好。
2） 產(chǎn)生歪斜的條帶通常由于不正確的pH梯度，檢查電極是否潔凈，是否同凝膠鏈接良好，同時應(yīng)該注意凝膠的邊緣效應(yīng)。
3） 蛋白帶的紋理現(xiàn)象是等電聚焦中經(jīng)常遇到的問題，可能是一下原因：
a，蛋白質(zhì)聚集或沉淀（尤其在等電點(diǎn)附近），或上樣量過大，8M尿素通常用來防止蛋白質(zhì)聚集，去垢劑Triton X－100和NP－40常用來防止膜蛋白的聚集，所以上樣前一定要離心以除去不溶解的顆粒；
b，樣品中殘存核酸，可以采用多種方法去除核酸污染，如酸抽提、鹽沉淀、核酸酶消化等；
c，蛋白質(zhì)修飾，非超純級的尿素中的異氰酸鹽污染物可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氨甲酰化，預(yù)電泳可以去除異氰酸鹽，蛋白質(zhì)樣品處理或儲存不當(dāng)會發(fā)生包括Cys殘基氧化，Asn或Gln殘基去氨基化等修飾過程；
d，波浪形條帶常由于樣品中鹽濃度過高，有時候載體兩性電解質(zhì)或電極液不純或電極不潔凈也會產(chǎn)生波浪形條帶；
e，電極同凝膠連接不平行，配置凝膠時候試劑不純，載體兩性電解質(zhì)濃度過低可導(dǎo)致不均等的pH梯度，若凝膠堿性部分pH梯度丟失，其可能原因是陽極飄移，可以補(bǔ)充pH9－11的載體兩性電解質(zhì)或進(jìn)行非平衡pH梯度電泳；
f，染色時候高背景的產(chǎn)生可能由于固定后載體兩性電解質(zhì)仍殘留于凝膠中，增加1％三氯乙酸的固定時間可解決；
g，蛋白質(zhì)條帶丟失或過淡可能由于蛋白質(zhì)分子量較低（<10kDa〉或蛋白質(zhì)在固定中未被變性，增加三氯乙酸濃度或使用戊二醛固定即可；
h，復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物等電聚焦后可以產(chǎn)生相互重疊的斑點(diǎn)，改變等電聚焦凝膠pH范圍可以解決此問題。進(jìn)一步的蛋白質(zhì)純化或沉淀處理可以避免重疊斑點(diǎn)的產(chǎn)生。
9．其他要注意的事項
1）等電聚焦后可用一根染色的細(xì)線（0.1mm）標(biāo)出染料前沿的位置；
2）不同品牌的載體兩性電解質(zhì)性質(zhì)上有細(xì)微的差別，使用不同來源的載體兩性電解質(zhì)凝膠時候蛋白質(zhì)分離樣式略有差異，若要獲得好的重復(fù)性一般不要更換載體兩性電解質(zhì)的品牌；
3）通常，窄范圍的pH梯度可以提高分辨率，但是需要時間也比較常，pH梯度范圍為2是較好的選擇；
4）由于電源和凝膠冷卻系統(tǒng)的限制，長的凝膠長度為8－10cm，實(shí)際上，分別電泳幾塊不同的pH梯度的凝膠比只電泳一塊較長凝膠效果更好；
5）當(dāng)?shù)入娋劢闺娪緯r間很長時候（>3000V·h），由于載體兩性電解質(zhì)不穩(wěn)定造成的陰極漂移將成為嚴(yán)重問題，陰極漂移會破壞pH梯度，尤其是pH8以上的梯度，為了克服此問題，開發(fā)了一種較短時間（1600V·h）完成等電聚焦電泳的技術(shù)，即非平衡pH梯度電泳，這樣可以在高pH范圍內(nèi)聚焦蛋白質(zhì)，但該方法不能用來測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)。
6）尿素可以促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解，并消除蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)－脂類相互作用，可增加聚焦速度和提高分辨率，同時抑制陰極漂移，但是也要注意變性蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)可能同天然蛋白有所差異。
7）若蛋白溶液中含有SDS，可加入尿素至終濃度8M，在高濃度的尿素下，SDS同蛋白質(zhì)的相互作用極小。
8）在變性液中加入2%Triton X－100以保證蛋白質(zhì)（尤其是膜蛋白）的充分溶解，有些作者推薦使用如CHAPS和Zwittergent3－14等兩性離子去垢劑；
9）超薄凝膠（50-500um）比常用標(biāo)準(zhǔn)等電聚焦更有優(yōu)勢，因?yàn)楦唠妶鰪?qiáng)度和更佳的冷卻效果使聚焦速度更快，分辨率更高。
10）在聚丙烯酰胺等電聚焦凝膠中，高分子量蛋白質(zhì)（>750kd）常常表現(xiàn)異常的遷移行為，瓊脂糖凝膠或瓊脂糖－丙稀酰胺凝膠較適用于高分子量蛋白質(zhì)。
11） 考馬斯亮藍(lán)染色中，三氯乙酸固定后用0.25％SDS的乙醇：醋酸：水（33：10：57）溶液洗滌凝膠10-30min可以進(jìn)一步改善染色效果。SDS同載體兩性電解質(zhì)結(jié)合后可以更好的去除載體兩性電解質(zhì)。
10.固相pH梯度等電聚焦電泳
簡介：固相pH梯度等電聚焦是80年代建立起來的一種等電聚焦技術(shù)，其所用的介質(zhì)是一些具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙稀酰胺衍生物，它們于丙稀酰胺和甲叉雙丙稀酰胺有相似的聚合行為。固定化電解質(zhì)一端的雙鍵可以在聚合中共價結(jié)合到聚丙烯酰胺介質(zhì)中，其另一端的R集團(tuán)為弱酸或弱堿，可在聚合物中形成弱酸或弱堿的緩沖體系，利用緩沖體系滴定終點(diǎn)附近一段pH范圍就可行成近似線性的pH梯度，所以固相pH梯度與載體兩性電解質(zhì)pH梯度的區(qū)別在于前者的分子不是兩性分子，在凝膠聚合時候便形成pH梯度，不隨環(huán)境電場條件的改變而改變，后者是兩性分子，在電場中遷移到自己的等電點(diǎn)后才形成pH梯度。固相pH梯度等電聚焦比傳統(tǒng)等電聚焦具有更高的分辨率，更大的上樣量，其分辨率可達(dá)到0.001pH，是目前分辨率高的電泳方法之一。
標(biāo)簽：
凝膠成像
- 變性梯度凝膠電泳技術(shù)介紹
- 凝膠電泳常用的四種蛋白質(zhì)染色方法原理及優(yōu)缺點(diǎn)
- 瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)及凝膠成像分析系統(tǒng)使用過程中的注意事項
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