凝膠電泳常用的四種蛋白質(zhì)染色方法原理及優(yōu)缺點

凝膠電泳是研究蛋白質(zhì)性質(zhì)的一種相對簡單、快速和高靈敏度的工具。它是分析化學、生物化學和分子生物學的主要工具。通過電泳分離蛋白質(zhì)是基于這樣一個事實，即帶電分子將在施加電場時通過基質(zhì)遷移。蛋白質(zhì)電泳分離的基質(zhì)是聚丙烯酰胺。用于形成聚丙烯酰胺的化學試劑是單體丙烯酰胺和N，N'-雙丙烯酰胺（雙-丙烯酰胺）。聚合丙烯酰胺和雙丙烯酰的方法是使用TEMED（四*基乙二胺）和過硫酸銨。聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)部的聚合形成了一個交聯(lián)的微孔網(wǎng)絡。這種孔隙網(wǎng)絡允許小蛋白質(zhì)分子快速通過，同時減緩較大蛋白質(zhì)的遷移，這導致蛋白質(zhì)基于其分子大小實現(xiàn)分離。凝膠電泳是一種檢測蛋白質(zhì)純度、評估蛋白質(zhì)分子量的強有力的生化分析方法。在電泳系統(tǒng)中,蛋白條帶染色是一個重要的步驟，因為它直接關系到試驗結果能否使用。目前，常用的蛋白質(zhì)染色方法主要有考馬斯亮藍染色法、銀染法、負染法和熒光染色法。

考馬斯亮藍染色法
發(fā)展歷史：1963 年 Fazekas 等首次將考馬斯亮藍R-250應用到醋酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)染色。1965年Meyer等人將該方法用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白的染色，其檢測靈敏度約為200~500ng。隨后考馬斯亮藍染色法逐漸被推廣使用，現(xiàn)已成為各實驗室必備的檢測方法。染色原理：考馬斯亮藍是二磺酸化的三苯甲烷類染料，在酸性條件下，該染料可通過磺酸基和蛋白質(zhì)分子上質(zhì)子化的堿性氨基酸間通過靜電相互作用相結合。其次，該染料還可以通過其疏水性基團(苯環(huán))和蛋白質(zhì)的疏水性區(qū)域產(chǎn)生疏水作用力，同時該染料和蛋白還存在氧鍵和范德華力的作用。

目前廣泛用的考馬斯亮藍有G-250和R-250兩種，R-250比G-250少2個甲基。游離狀態(tài)的考馬斯亮藍G250在酸性溶液中呈藍偏綠色，與蛋白質(zhì)結合后呈藍色，考馬斯亮藍G-250由于與蛋白質(zhì)的結合反應十分迅速，常用于蛋白質(zhì)含量的測定，也可染膠，但脫色較慢較難。考馬斯亮藍R-250呈藍色，有輕微紅色，與蛋白質(zhì)反應雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去，所以常用來對電泳條帶染色。
 
考馬斯亮藍染色法的優(yōu)點：由于考馬斯亮藍具有成本低、操作便捷及質(zhì)譜兼容性好等特點，使得該類染料成為最常用的蛋白質(zhì)染色染料�？捡R斯亮藍染色法的缺點：染色靈敏度低，約為幾十納克到幾微克，對低豐度蛋白質(zhì)的顯色較差；染色時間長，并且凝膠有比較深的背景，需要較長時間的脫色，實驗時間較長；由于染色和脫色過程中會使用到甲醇和冰乙酸等有毒或有刺激性氣味試劑，對身體健康有害。

銀染法
發(fā)展歷史：1979年，Switzer等發(fā)明了更靈敏的銀染色方法，該方法比考馬斯亮藍染色靈敏高出2個數(shù)量級，它可以檢測小至0.38ng/mm2的牛血清白蛋白。

銀染法的原理：在溶液條件下銀離子能與蛋白質(zhì)的天冬氨酸和谷氨酸上的羧基通過靜電力相結合，同時銀離子還可與組氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和賴氨酸上的咪唑、甲硫基、巰基和氨基結合；接著，在堿性條件下，與蛋白質(zhì)結合的銀離子在甲醛等還原劑的還原作用下生成黑褐色的金屬銀使蛋白質(zhì)顯色。
銀染法優(yōu)點：靈敏度高，可以檢測到0.25~1ng的蛋白質(zhì)，適用于低豐度蛋白質(zhì)染色。

銀染法缺點：甲醛的使用讓凝膠中蛋白化學交聯(lián)，導致質(zhì)譜不兼容；線性范圍窄，不太適合量化；染色步驟復雜，染色過程污染較大，費時費力(需要8～16h)；試劑成本較高，需要接觸有毒的甲醛；而且,核酸、脂多糖、脂類、醣脂類化合物常會對銀染染色的結果進行干擾，導致實驗重復率低。

負染法
1987年，LeeC等首次發(fā)明了蛋白質(zhì)銅負染法，只需五分鐘即可SDS-PAGE凝膠上清晰顯示6-10ng蛋白質(zhì)條帶。
蛋白質(zhì)負染法的原理是：將金屬離子有選擇地沉淀在膠面上，而蛋白質(zhì)條帶不被染色。因此，蛋白質(zhì)所處區(qū)域是透明的，從而達到檢測目的。該方法主要包括氯化鉀負染法、氯化銅負染法、氯化鋅負染法、氯化鎳負染法、醋酸鹽負染法和咪唑鋅負染法等。
負染法的優(yōu)點：操作便捷，成本較低。咪唑鋅負染靈敏度接近于銀染法(1～10ng)，蛋白質(zhì)與鋅和咪唑的結合是可以逆轉的，洗脫后的蛋白質(zhì)化學性質(zhì)沒有改變，因而具有良好的質(zhì)譜兼容性。
負染法的缺點：對比度較差，重現(xiàn)性容易受到多種物理化學因素的影響(例如染色液的pH、溫度，膠中陰離子的濃度等)，從而限制本方法的廣泛使用。

熒光染色法
針對考馬斯亮蘭染色雖然快速但是靈敏度不夠，銀染法雖然靈敏度高但是背景較高，結果容易受到核酸，脂類的污染等缺點,人們開始使用熒光染料對凝膠中的蛋白質(zhì)條帶進行染色。
熒光染色法原理是：熒光染料通過靜電作用與SDS包裹的質(zhì)子化蛋白質(zhì)相結合，搭配熒光掃描儀成像來檢測蛋白。
熒光染色法的優(yōu)點：蛋白質(zhì)熒光染色法具有線性范圍廣,靈敏度高(1~100ng／band)，質(zhì)譜兼容性好，適用于高通量蛋白質(zhì)組學的研究。
熒光染色法的缺點：會用到強烈氣味和刺激性的試劑，使用的試劑一般價格比較昂貴；熒光染色一般需要相對較長的處理時間，并且需要配備熒光成像掃描儀之類的特殊設備；熒光染料標記蛋白后會改變其在凝膠中的遷移性質(zhì)，不同蛋白質(zhì)樣品含有與熒光染料反應的氨基殘基不同，導致最終檢測到的信號差別比較大；電泳前進行染料標記容易使蛋白質(zhì)形成發(fā)夾結構，造成蛋白質(zhì)從凝膠向硝酸纖維素濾膜上轉移時出現(xiàn)障礙；此外，熒光染料的化學穩(wěn)定性相對較差、光漂白和光降解現(xiàn)象比較嚴重。以上因素導致該方法的普及和使用率較低。
 
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