Nature Plants：多組學(xué)探討自噬如何通過ATG8相關(guān)途徑來影響玉米的細(xì)胞生理進(jìn)程

【多組學(xué)】Nature Plants：玉米瘋起來居然連自己都吃！

玉米，作為一種深受廣大人民群眾喜愛的食物，出現(xiàn)在了全國(guó)大部地區(qū)的餐桌上，主食亦可、做菜亦可、零食亦可……簡(jiǎn)直就是居家旅行，必備食物。人們餓了吃玉米，玉米餓了吃什么呢？它真的會(huì)吃自己……

這不是個(gè)玩笑，在缺氮條件下，玉米會(huì)利用自噬來完成細(xì)胞質(zhì)的回收再利用……近期發(fā)表于植物學(xué)頂級(jí)期刊《Nature Plants》（IF=11.471）的研究，利用多組學(xué)聯(lián)合的方式，在多個(gè)維度上分析了玉米自噬與缺氮脅迫的聯(lián)系。

和真菌、動(dòng)物一樣，玉米的自噬操作也是由一系列ATG相關(guān)蛋白來共同參與完成的。而這次的研究，需要談?wù)摰氖茿TG8介導(dǎo)的自噬通路。ATG8是一個(gè)泛素樣蛋白，在ATG12-ATG5-ATG16這個(gè)E3樣酶的輔助下，與磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合形成ATG8-PE復(fù)合體。ATG8-PE定位于自噬膜上，在自噬膜形成及與液泡的融合過程都扮演著十分重要的角色。

實(shí)驗(yàn)材料

為了探討自噬如何通過ATG8相關(guān)途徑來影響玉米的細(xì)胞生理進(jìn)程，研究者選用了自噬受損的atg12突變體atg12-1（無效等位基因）、atg12-2（基因敲減）與野生型（W22）作為實(shí)驗(yàn)材料，在富氮、缺氮條件下進(jìn)行培養(yǎng)。由于固氮效率和源-庫(kù)系統(tǒng)有著緊密聯(lián)系，研究團(tuán)隊(duì)選擇了玉米幼苗的第二片葉和第四片葉分別作為取樣對(duì)象。因此，這個(gè)研究從轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組和離子組等多個(gè)層面對(duì)比分析野生型和atg12突變體在（+/- N）條件下的差異，從而探討自噬對(duì)于細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的影響。

多組學(xué)研究中，往往會(huì)因?yàn)楦鱾�(gè)層面的結(jié)果較多，而在聯(lián)合分析上出現(xiàn)困難，那么我們來看看這篇文章是如何來處理這些數(shù)據(jù)的吧~

1. 缺氮脅迫與自噬缺失帶來的影響——材料的表型分析

在突變體材料獲得以后，首先要做的事情，當(dāng)然是討論材料的表型差異，來證明自己選擇的材料具有代表性啦~

首先，研究人員在富氮條件下培養(yǎng)了2周后，在缺氮條件下培養(yǎng)了1周，讓玉米幼苗們經(jīng)歷了吃飽又挨餓的過程（呃……它們真的還是孩子啊……）。玉米幼苗在經(jīng)歷了大起大落以后，此時(shí)已處在了缺氮脅迫當(dāng)中。此時(shí)，野生型玉米幼苗生長(zhǎng)受到了明顯的抑制，而且已經(jīng)出現(xiàn)了黃萎病的前兆。蛋白組和轉(zhuǎn)錄組的GO分析結(jié)果顯示，在缺氮條件下，氮代謝及其他響應(yīng)缺氮脅迫的通路轉(zhuǎn)錄上調(diào)，而葉綠體組分的表達(dá)和積累被抑制。

那么突變體的表現(xiàn)如何呢？

首先，這兩種atg12突變體不能或不能很好地積累ATG8-PE，并表現(xiàn)出自噬缺失表型，如阻礙自噬體形成、對(duì)缺氮高度敏感、從源到庫(kù)的固氮能力較差等等。

果然，在沒有缺氮的情況下，atg12-1和atg12-2植株的第二葉ATG8蛋白水平在沒有氮脅迫的情況下顯著升高。這說明atg12突變對(duì)于ATG8蛋白的周轉(zhuǎn)產(chǎn)生了影響，也說明實(shí)驗(yàn)材料選擇得很有針對(duì)性。而沒有了自噬的約束，突變體的蛋白總量積累增加，這也說明了自噬對(duì)蛋白總量維持在正常水平具有十分重要的作用。

在經(jīng)過富氮-缺氮的歷程以后，它們和野生型的表型上出現(xiàn)了明顯的差異：與野生型相比，atg12-2和atg12-1的幼苗，隨著自噬缺失程度的增加，葉片黃變更明顯，葉片伸長(zhǎng)更慢，葉綠素積累越少，葉片衰老越快。

2. 自噬對(duì)于代謝有哪些影響？——非靶向代謝組學(xué)分析

既然表型出現(xiàn)了明顯的變化，那么代謝水平是否發(fā)生改變，以及發(fā)生了哪種改變就很值得好好研究一下了。畢竟，代謝組是表型的靈魂畫師嘛~~此時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)atg突變體和野生型進(jìn)行了兩種處理。+N：在富氮條件下培養(yǎng)三周，-N：在富氮條件下培養(yǎng)了2周后，在缺氮條件下培養(yǎng)了1周，然后再分別取第二片葉和第四片葉。此后，他們利用LC-MS進(jìn)行的非靶向代謝組學(xué)分析，比對(duì)六組處理的葉片代謝水平。結(jié)果顯示，第二和第四葉片中分別有218種和204種代謝產(chǎn)物的水平發(fā)生了顯著的變化，而這兩組差異代謝物有較高的重疊（約75%）。

讓研究團(tuán)隊(duì)沒有想到的是，這些代謝變化在富氮條件下的植株中表現(xiàn)得更為強(qiáng)烈，這表明自噬即使在正常生長(zhǎng)條件下也會(huì)對(duì)玉米代謝產(chǎn)生重大影響。而PCA分析結(jié)果也呈現(xiàn)了同樣的趨勢(shì)，缺氮脅迫和自噬突變對(duì)于葉片的代謝有著不同的影響。這也說明了缺氮脅迫激活了自噬之外的其他分解代謝途徑，以幫助應(yīng)對(duì)這一營(yíng)養(yǎng)挑戰(zhàn)。

那么自噬對(duì)哪些代謝物影響最大呢？代謝網(wǎng)絡(luò)聚類分析顯示了atg12背景下影響最顯著的化合物集中于脂類和次生代謝物。雖然碳水化合物和氨基酸代謝沒有發(fā)生廣泛的變化，但芳香族氨基酸呈現(xiàn)出了顯著差異。

3. 代謝變化背后的分子機(jī)制——轉(zhuǎn)錄組分析

研究團(tuán)隊(duì)預(yù)測(cè)，atg12突變體的代謝物變化是由基因表達(dá)和蛋白質(zhì)組成的改變所支撐的，所以先對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析。atg12-1、atg12-2與野生型相比，分別有3082個(gè)和2426個(gè)轉(zhuǎn)錄本顯著變化，而這些差異呈現(xiàn)出了較高的相關(guān)性。與代謝組學(xué)數(shù)據(jù)類似，缺氮和atg12突變產(chǎn)生了明顯的影響，atg12-1受到的影響較atg12-2更大。

研究人員將在三種或是四種處理中均有差異的轉(zhuǎn)錄本，作為核心轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能分析（圖c白色數(shù)字標(biāo)識(shí)）。結(jié)果表明，自噬突變體中蛋白酶和脂質(zhì)代謝轉(zhuǎn)錄上調(diào)。

 

4. 代謝變化背后的分子機(jī)制——蛋白組分析

由于轉(zhuǎn)錄組只代表可能的機(jī)制，為了進(jìn)一步進(jìn)行功能分子水平的確認(rèn)，研究者進(jìn)一步進(jìn)行了Label free蛋白質(zhì)組分析。此次在第二片葉和第四片葉中分別鑒定到了3,327和3,801個(gè)蛋白。PCA分析顯示，不同氮素利用率和基因型的影響似乎不相關(guān)，氮脅迫和自噬對(duì)蛋白質(zhì)組均有明顯的影響，而自噬對(duì)于蛋白組的影響大于氮脅迫。

分析整體趨勢(shì)以后，研究人員進(jìn)一步分析了基因型帶來的蛋白差異：在突變體與野生型之間，自噬的缺失使得大部分蛋白的豐度增加，GO結(jié)合差異分析顯示，許多細(xì)胞成分和生物過程的表達(dá)出現(xiàn)顯著差異，如光合作用、過氧化物酶體、ER等。而在缺氮條件下，線粒體、過氧化物酶體、ER等相關(guān)蛋白也表現(xiàn)出了顯著差異，但差異程度要小于自噬的影響。 

5. 缺氮脅迫下自噬及轉(zhuǎn)錄不同的影響——蛋白組+轉(zhuǎn)錄組對(duì)比與聯(lián)合

通過觀察突變體在富氮與缺氮條件下的蛋白變化，可以幫助我們獲得三方面信息：自噬缺失帶來的差異，轉(zhuǎn)錄翻譯（合成）帶來的差異，以及兩者共同帶來的差異。研究團(tuán)隊(duì)基于這個(gè)目的，進(jìn)行了蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了聯(lián)合分析。2729個(gè)蛋白和轉(zhuǎn)錄本被關(guān)聯(lián)，其中有52%在mRNA和/或蛋白水平差異顯著。相關(guān)性分析顯示，大多數(shù)僅在蛋白豐度上發(fā)生了顯著的變化，這說明atg12-1突變體中大多數(shù)蛋白的升高與轉(zhuǎn)錄翻譯無關(guān)。

GO聯(lián)合分析結(jié)果顯示，苯基丙酮和氨基酸代謝過程在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上都呈現(xiàn)了顯著上調(diào)，這與代謝組獲得的結(jié)果一致。atg12-1葉片中蛋白質(zhì)水平的升高可能是由抑制自噬清除導(dǎo)致。值得注意的是，這些豐度增加的蛋白主要是過氧化物酶體，高爾基體、細(xì)胞溶膠、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、蛋白酶體及脂肪酸和蛋白質(zhì)分解代謝等相關(guān)蛋白，其中一些是自噬的作用對(duì)象。在atg12-1葉片中，有兩類蛋白酶僅mRNA含量升高，而類囊體和液泡相關(guān)蛋白則在蛋白水平有差異，而mRNA水平并無顯著變化。類囊體的富集和葉綠體加速分解的現(xiàn)象共同說明在自噬缺失的情況下，有可能激活了其他驅(qū)動(dòng)分解代謝途徑。

而通過結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)錄的結(jié)果，研究人員進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在苯丙代謝和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān)的蛋白質(zhì)和mRNA呈正相關(guān)，這著這些通路及其相關(guān)代謝物（至少部分）由合成驅(qū)動(dòng)，可能是植株對(duì)脅迫的響應(yīng)。而過氧化物酶體脂肪酸分解代謝和蛋白酶體相關(guān)蛋白的豐度變化則更多地受到自噬的影響，這與其他團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果一致。同時(shí)，突變體中參與脂肪酸β氧化的過氧化物酶增加，并沒有導(dǎo)致脂肪酸水平下降，反而存在脂肪酸和脂質(zhì)分解產(chǎn)物的大量積累的現(xiàn)象，這種不一致的很有可能是由于自噬受損導(dǎo)致的。

在討論組學(xué)結(jié)果時(shí)，必不可少的就是驗(yàn)證。研究團(tuán)隊(duì)分別使用RT-qPCR和免疫印跡在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上了進(jìn)行數(shù)據(jù)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，在缺氮脅迫條件下，自噬的周轉(zhuǎn)會(huì)加速。而對(duì)于ATG相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)結(jié)果顯示，自噬受到抑制時(shí)，會(huì)在轉(zhuǎn)錄層面上激活相關(guān)通路。而對(duì)應(yīng)蛋白的豐度主要受自噬周轉(zhuǎn)的影響。

6. 自噬調(diào)控代謝通路的系統(tǒng)畫像——結(jié)果總結(jié)

在做完各個(gè)組學(xué)的分析以后，研究團(tuán)隊(duì)將代謝物、蛋白質(zhì)和/或轉(zhuǎn)錄本豐度的變化疊加到代謝途徑圖上，對(duì)自噬調(diào)控代謝進(jìn)行系統(tǒng)的描繪，重點(diǎn)關(guān)注了脂類代謝、脂肪酸β氧化以及部分次生代謝途徑。（這種簡(jiǎn)化的通路畫像往往可以給文章錦上添花~~~知識(shí)點(diǎn)哦，朋友們！）

最終的結(jié)論是，自噬在富氮生長(zhǎng)條件下也能顯著改變玉米蛋白質(zhì)組，并強(qiáng)烈改變?nèi)~片代謝，尤其是在膜周轉(zhuǎn)率和隨后的脂質(zhì)分解以及次生產(chǎn)物積累方面。多組學(xué)分析有助于系統(tǒng)識(shí)別自噬與植物代謝之間的聯(lián)系，今后可以在實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，用于調(diào)節(jié)作物中脂類、油脂、抗氧化劑、次生代謝產(chǎn)物和蛋白質(zhì)的含量。

小編心得

這篇文章使用同樣的樣本對(duì)玉米代謝組、轉(zhuǎn)錄組、離子組和蛋白質(zhì)組進(jìn)行深入的、非靶向的分析，并結(jié)合核心自噬調(diào)控因子（ATG12）的突變體，來探討自噬是如何更廣泛地影響植物代謝的。在這個(gè)研究中，小編get到了以下幾點(diǎn)：

1. 使用相同的樣本，有助于尋找多組學(xué)數(shù)據(jù)集之間的可靠聯(lián)系。

2. 各個(gè)組學(xué)數(shù)據(jù)，各司其職，有機(jī)整合：代謝組數(shù)據(jù)描述表型變化；轉(zhuǎn)錄和蛋白數(shù)據(jù)聯(lián)合分析探討機(jī)制（本文的結(jié)果再次表明，兩者不一致性非常高），重點(diǎn)關(guān)注發(fā)生變化的相關(guān)代謝通路所涉及的基因和蛋白，作為代謝組數(shù)據(jù)的有效支撐。

3. 多組學(xué)聯(lián)合分析的方法與角度：（1）趨勢(shì)分析：PCA從整體上直觀反映出多個(gè)組學(xué)層面的趨勢(shì)異同；相關(guān)性分析對(duì)轉(zhuǎn)錄+蛋白的差異數(shù)據(jù)進(jìn)行有效分類，分門別類地探討各種趨勢(shì)數(shù)據(jù)所攜帶信息。（2）機(jī)制調(diào)控分析：代謝通路圖將代謝物、蛋白質(zhì)和/或轉(zhuǎn)錄本豐度的變化疊加在一起，以直觀明了的形式凸顯了此次研究的重點(diǎn)。

4. 對(duì)于涉及到交叉對(duì)比的數(shù)據(jù)分析，往往需要明確差異所代表的信息，才能夠更好地解讀海量數(shù)據(jù)背后的信息。還是那句話，數(shù)據(jù)分析的靈魂來自于有趣的研究思路~~~
 

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