血球計(jì)數(shù)板的發(fā)展

引言
血球計(jì)數(shù)板作為醫(yī)生和生物學(xué)家的必備工具已經(jīng)有超過100年的歷史，它最初被醫(yī)生用來研究病人的血液樣品，并由此開創(chuàng)了“血液學(xué)”這個研究領(lǐng)域。在十八世紀(jì)和十九世紀(jì)早期，血球計(jì)數(shù)板經(jīng)歷了一系列的重大發(fā)展。Jack David Davis在論文“The Hemocytometer and Its Impact on Progressive-Era Medicine”中對血球計(jì)數(shù)板的發(fā)展歷程做了詳細(xì)介紹[1]。在此我們?yōu)榇蠹姨峁〥avis論文的簡介，以期廣大讀者能夠了解血球計(jì)數(shù)板的前世今生。
 
血球計(jì)數(shù)板的發(fā)展
1852年，德國科學(xué)家Karl Vierdordt (1818-1884)發(fā)明了第一個精確計(jì)數(shù)紅細(xì)胞的方法。他使用內(nèi)徑和長度分別為0.1-0.2 mm和5-8 mm的毛細(xì)管吸取血液樣品；在樣品加載到毛細(xì)管之后，就可以通過測量毛細(xì)管內(nèi)徑和樣品長度來獲得精確的樣品體積；之后將血樣涂到包被了蛋清的玻璃板上并晾干；最后使用配備刻度目鏡的顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。雖然這種方法費(fèi)時費(fèi)力，但可以獲得非常精確的計(jì)數(shù)結(jié)果。
 
二十二年后的1874年，Louis Charles Malassez (1842-1909)發(fā)明了一種新的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。如圖1所示，他將扁平的毛細(xì)管粘合到玻璃板上作為計(jì)數(shù)室。玻璃板上帶有標(biāo)尺，可以將毛細(xì)管長度轉(zhuǎn)換為樣品體積。通過計(jì)數(shù)毛細(xì)管中紅細(xì)胞的數(shù)量，再乘以稀釋倍數(shù)就可以獲得細(xì)胞濃度[1, 2]。  
1875年，Georges Hayem (1841-1933)發(fā)明了另一種計(jì)數(shù)板。他在玻璃板上粘上一塊0.2 mm厚，帶有直徑1 mm孔洞的玻璃片（如圖）。一滴血樣直接加到孔里，然后蓋上蓋玻片。接下來使用帶有標(biāo)尺（0.2 mmX0.2 mm）的顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)合孔洞高度（0.2 mm）就可以計(jì)算獲得細(xì)胞濃度（圖2）。由于樣本的加載沒有通過虹吸作用，細(xì)胞的分布并不均勻。雖然Hayem制造并銷售了他的產(chǎn)品，但因?yàn)闇?zhǔn)備步驟的繁瑣和存在計(jì)數(shù)一致性較差的問題而沒有獲得廣泛接受 [1, 2]。  
1877年，William Gowers (1845-1915)改進(jìn)了Hayem的計(jì)數(shù)板，簡化了計(jì)數(shù)方法。因?yàn)橹�前的�?jì)數(shù)方法需要特殊的顯微鏡（帶有校準(zhǔn)過標(biāo)尺的目鏡），使用非常不方便。William與Hawksley合作發(fā)明了第一個直接在玻璃板上帶有標(biāo)尺的計(jì)數(shù)室。標(biāo)尺設(shè)計(jì)成0.1 mmX0.1 mm的方格，計(jì)數(shù)室厚度是0.2 mm，由此可精確確定樣品體積以及細(xì)胞濃度（圖3）。1906年，William將標(biāo)尺優(yōu)化為0.1 mmX0.2 mm的長方格。但因?yàn)闆]有在行業(yè)期刊上發(fā)表，William的計(jì)數(shù)板也沒有獲得廣泛接受 [1, 2]。  
接下來的改進(jìn)由Richard Thoma (1847-1923)在1881年完成，主要是計(jì)數(shù)室高度的定型和網(wǎng)格的增加。他首先將一塊中間有11 mm直徑圓孔的玻璃片粘貼到玻璃板上，然后在圓孔中央再粘上一塊直徑5 mm的玻璃圓片。外層玻璃片比內(nèi)層玻璃片厚0.1 mm，因此自然形成了一個高度為0.1 mm的計(jì)數(shù)室。玻璃板底部中央1 mm²的區(qū)域被劃分成16個中方格，每個中方格再分為25個小方格；每個中方格的大小是0.25 mmX0.25 mm （圖4）。這種計(jì)數(shù)板由卡爾蔡司公司和耶拿公司制造。  
1884年，俄國科學(xué)家Sergei Alferow設(shè)計(jì)了新型的計(jì)數(shù)板。Alferow的計(jì)數(shù)板通過兩條平行的溝槽將計(jì)數(shù)室與板分開。計(jì)數(shù)室的高度通過四個帶刻度的螺絲控制，樣品通過虹吸作用加入計(jì)數(shù)室，以增加細(xì)胞在計(jì)數(shù)室中分布的均一度 （圖5）。Alferow是第一個對計(jì)數(shù)板中細(xì)胞進(jìn)行顯微拍照的人。他將照片投射在帶有刻度的玻璃板上，再用鉛筆將每個細(xì)胞標(biāo)識和計(jì)數(shù)。他相信他的方法能得到更準(zhǔn)確的結(jié)果，因?yàn)轱@微照片是計(jì)數(shù)板中細(xì)胞狀況最真實(shí)的記錄 [1, 2]。  
1903年，W. Brünings發(fā)明了一種集混樣和加樣于一體的計(jì)數(shù)板。他將計(jì)數(shù)板和一個混樣室用吸液管連接。當(dāng)血樣在吸液管內(nèi)混合后便會被直接轉(zhuǎn)移至計(jì)數(shù)室（圖6）。這種計(jì)數(shù)板可以稱得上是“芯片實(shí)驗(yàn)室技術(shù)”的最早應(yīng)用了[1, 2]。  
對提高血球計(jì)數(shù)板易用性和精度做出最大貢獻(xiàn)的是Karl Bürker (1872-1957)。Bürker的計(jì)數(shù)板由一塊重玻璃板和粘到玻璃板上的三個平臺構(gòu)成。三個平臺在玻璃板上平行排列；中間的平臺（25 mm x 5 mm）被一段1.5 mm寬的溝槽分成兩部分，兩端呈圓形；兩側(cè)的平臺(21 mmx 7.5 mm)比中間的平臺高0.1 mm，與其被一條1.5 mm寬的通道分開。蓋玻片蓋到兩側(cè)的平臺上之后，就形成了0.1 mm的深度。中間平臺的兩部分各有一個標(biāo)尺，標(biāo)尺面積是1 mm²，被劃分成了400個小方格。Bürker的計(jì)數(shù)板通過毛細(xì)管作用加載樣品；計(jì)數(shù)板上有兩個計(jì)數(shù)室，無需清洗就可以對樣品進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)（圖7）。通過這一系列成功的改進(jìn)，Bürker的計(jì)數(shù)板成為1921年前最常用的一類血球計(jì)數(shù)板 [1, 2]。  
 
血球計(jì)數(shù)板網(wǎng)格的改進(jìn)
血球計(jì)數(shù)板的網(wǎng)格經(jīng)歷過多次改良。Thoma在1879年的設(shè)計(jì)的網(wǎng)格為早期的血球計(jì)數(shù)板奠定了基礎(chǔ)。但隨著血液學(xué)研究的發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)這樣的網(wǎng)格不適合白細(xì)胞的檢測，因?yàn)榘准?xì)胞的體積比紅細(xì)胞和血小板都大。
 
1892年，J. Zappert將網(wǎng)格的面積擴(kuò)大至9 mm²，由九個1 mm²大小的區(qū)域組成。1894年，A. Elzholz在左側(cè)和右側(cè)各增加了三組豎線。1902年，W. Türk在Elzholz的基礎(chǔ)上又增加了三組橫線。此時的網(wǎng)格已與當(dāng)今的血球計(jì)數(shù)板類似。1907年，O. Neubauer將雙線改為了單線，進(jìn)一步簡化了網(wǎng)格的設(shè)計(jì)（圖8）[1]。  
總結(jié)
經(jīng)過一個世紀(jì)的改進(jìn)，血球計(jì)數(shù)板從其雛形發(fā)展成了現(xiàn)今全世界通用的精密工具（圖9）。雖然血球計(jì)數(shù)板有不同的型號，但無論在實(shí)驗(yàn)研究還是臨床診斷領(lǐng)域，它依然是細(xì)胞計(jì)數(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)。在下一篇文章中，我們會和大家分享使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的誤差來源和減少誤差的方法，以提高細(xì)胞計(jì)數(shù)以及下游實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度。  
參考文獻(xiàn)
1.      Davis, J.D., THE HEMOCYTOMETER AND ITS IMPACT ON PROGRESSIVE-ERA MEDICINE, in Department of History1995, University of Illinois at Urbana-Champaign: Urbana. p. 268.
2.     Verso, M.L., Some Nineteenth-Century Pioneers of Haematology. Medical History, 1971. 15(1): p. 55-67.
3.     Rouge, M. Counting Cells with a Hemacytometer. 2002; Available from: http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/semeneval/hemacytometer.html.
 
 
Nexcelom和達(dá)科為
Nexcelom Bioscience于2003年成立于美國波士頓，是高性能細(xì)胞定量分析平臺開發(fā)和商業(yè)化的領(lǐng)導(dǎo)者。作為一家全球性公司。自2005年成功開發(fā)第一款細(xì)胞計(jì)數(shù)儀Cellometer Auto T4并得到NIH客戶認(rèn)可以來，已陸續(xù)開發(fā)出Cellometer明場、熒光以及圖像類流式細(xì)胞定量分析儀系列。
2014年從Brooks生命科學(xué)部成功收購Celigo全視野原位細(xì)胞分析儀產(chǎn)品線，快速整合并提升公司在細(xì)胞定量技術(shù)上的研發(fā)能力和客戶應(yīng)用支持實(shí)力。
Cellometer和Celigo被廣泛應(yīng)用于新藥研發(fā)、免疫治療、疫苗開發(fā)、藥物評價等基礎(chǔ)生命科學(xué)研究以及釀酒、生物能源等工藝開發(fā)。目前，在全球范圍內(nèi)的裝機(jī)數(shù)已達(dá)5000多臺，被經(jīng)同行評議的文獻(xiàn)引用已超3200篇。
達(dá)科為生物作為Nexcelom公司在中國的總代理，和Nexcelom公司強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)手，在中國擁有強(qiáng)大的技術(shù)團(tuán)隊(duì)，提供專業(yè)的demo演示，以及售后支持和維護(hù)。