【文獻重現(xiàn)】分子對接技術研究D715-2441 抑制劑與PB2蛋白的結合模式

從本期起，小編將帶領大家使用殷賦云計算平臺（http://cloud.yinfotek.com/）來做一系列計算“文章”。這一期咱們來重現(xiàn)一篇2018年文獻[1]的計算結果，看看作者是如何運用分子對接技術來闡明機理、升華文章的。該文獻影響因子4.6，是典型的“實驗+計算”模式，比較接近大多數科研人員的研究現(xiàn)狀，只要熟悉這種模式，稍加努力即可發(fā)表同等水平的論文。

文獻作者通過細胞MTT試驗從8000多個小分子中發(fā)現(xiàn)了一個新型的抗流感病毒化合物D715-2441。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，它對流感A病毒多種亞型（H1N1、H5N1、H7N9、H3N2、臨床分離株690（H3）和帶H274Y NA變異的奧司他韋抗性株）均有抗病毒活性，能夠抑制病毒復制的早期階段。更重要的是，D715-2441明顯抑制病毒聚合酶的活性，并且直接影響PB2蛋白的定位。結合親和力分析明確了該化合物特異性結合在PB2cap蛋白上。為了闡明抑制劑D715-2441的作用機理，文獻作者采用DOCK 6分子對接技術分析其結合模式。

簡單來說，分子對接的計算步驟包括4步：

1、 準備配體（小分子）和受體（生物大分子，比如蛋白）結構；

2、 定義對接口袋；

3、 進行對接計算；

4、 分析對接結果（打分與結合模式分析）。

下面，小編圖文并茂地教大家使用殷賦云計算平臺的DOCK6方案來完成對接計算與分析。本教程不打算詳盡地講解每一個操作步驟，僅將大體過程和關鍵要點講清楚。但講了很多值得注意的細節(jié)，這是一般教程上看不到的經驗之談。讀者如果對本平臺操作不是很熟悉，請翻看相應教程（分子對接結合模式預測教程）。

 

分子對接計算需要準備配體小分子和受體蛋白的三維結構。配體結構通常小而簡單，可用軟件構建，但蛋白結構大且復雜，通常采用實驗解析的結構，可從RCSB 蛋白數據庫下載。本工作用到的PB2cap蛋白PDB編號是4CB4，請自行登錄網址https://www.rcsb.org/structure/4CB4下載（4cb4.pdb文件）。

登錄平臺，創(chuàng)建項目，填寫內容。“簡略備注”和“詳細描述”是給你自己看的，可不填，但填寫備忘是個值得鼓勵的好習慣。然后，選擇計算方案或工具。在這里，我們選擇跟文獻同款的Dock6（結合模式預測）方案。之后，填寫任務內容。

平臺為準備配體分子提供了多種輸入方式，最簡單的莫過于在線畫結構（繪制小分子）。在畫板上畫出D715-2441的化學結構，并填上分子名稱（不要有中文、空格、特殊符號或除英文字母外的其他語言文字！）和點擊添加按鈕。

輸入的分子需要經過處理才能用于對接，其中包括：添加氫原子、添加電荷、生成3D結構和能量最小化。平臺已對大多數情況進行優(yōu)化設計，因此，采用默認設置即可。

值得注意的是：1、MMFF94力場是目前針對有機小分子最好的力場之一，也包括一些金屬元素[2]，但并非化學元素周期表全部元素都支持，必要時請使用UFF力場；2、電荷和能量優(yōu)化使用的力場最好一致。

點擊準備按鈕。

我們從視圖中看到經過處理的配體結構。盡管平臺已經做得很好，但人工檢查仍是必要的。請根據你的化學知識，仔細檢查結構是否正確，比如價鍵是否平衡、結構是否無扭曲、構型是否正確。確定無問題后，點擊確定按鈕；否則，返回前面，重新畫結構或采用其他輸入方式。

與配體不同，受體分子通常是生物大分子，無法通過手繪準備。平臺提供了其他輸入方式。點擊上傳文件，選擇剛才下載的4cb4.pdb文件，然后按提示進行下去。

通常來說，從PDB庫下載的晶體結構文件里邊包含了很多組分，不僅有（單條或多條）肽鏈，通常還有有機小分子和溶劑分子（水分子、金屬離子）。如果下載的是NMR結構，還可能包含多個蛋白構象（稱為model）。

在準備受體結構這一步，我們需要定義選用哪個模型（默認為1）、哪部分結構歸為受體、哪部分為配體（將被提取出來用于口袋定位；若沒有，可不定義）和其他雜質。在這里，我們選擇A:PROTEIN為受體，A:MGT1484為配體，沒有選上的部分將在后續(xù)處理中被程序刪除。

我們需要定義化合物D715-2441結合的大致區(qū)域——對接口袋。在上面的步驟中，我們提取了晶體結構中原先就存在的配體分子。通過文獻了解到，它的結合位置就是D715-2441可能的結合區(qū)域。事實上，對該蛋白而言，也只有這里才靠譜。

通過選擇文件方式，從彈出的文件列表選擇MGT.pdb，點擊顯示盒子。稍等片刻，視圖中將出現(xiàn)一個綠色盒子將MGT分子包圍。我們需要保證的是，該盒子足夠大，能夠把口袋包圍住。默認設置基本足夠，必要時可增大小球范圍（可能導致盒子擴大）。然后點擊生成格點。這一步通常比較久，請耐心等待。然后，點擊確定按鈕。

Dock6方案為我們提供了多種對接計算模式，這里稍微解釋一下。

在各種模式中，蛋白受體都是剛性不動的。因為Dock6的Grid算法實際上并非直接采用蛋白結構進行對接，而是采用其模型（正是前面生成的格點）。根據配體運動的方式，分為下面幾種情況：

1） 柔性配體對接，即配體在對接過程中是柔性可變的，可旋轉單雙鍵產生不同構象。這是最常用的默認的模式；

2） 固定錨點對接，即在口袋中對配體進行小范圍構象搜索，配體有一塊結構（通常為最大的剛性結構）看似被固定住，而其他部分則可變動。該模式的用處是，在保持配體整體結合位置不變的情況下，尋找更好的結合模式；

3） 剛性配體對接，即配體是剛性的，不能旋轉化學鍵，僅可整體平移和翻轉�？赡艿氖褂脠鼍笆�，配體的構象具有某種特殊意義，希望對接后保持不變，或者評估蛋白是否能夠容納這種構象；

4） 原位優(yōu)化（in-situ minimization），即在口袋中對配體分子進行能量優(yōu)化，不進行構象搜索�？捎糜趦�(yōu)化配體的結合模式；

5） 打分評價，即對口袋中的配體分子進行打分評價，不進行構象搜索�？刹捎貌煌�打分函數對配體某一結合模式進行重打分。

我們采用柔性配體對接模式，其他參數采用默認值，然后提交任務。

Dock6方案的對接總打分是Grid Score，負值表示有結合，正值表示不結合，因此，打分值越�。ㄘ撝档慕^對值越大）表示結合力越強。它與另外兩項能量項——范德華力和靜電力——的關系是：Grid Score = Grid_vdw + Grid_es。Internal Energy是分子內能，表示對接構象（pose）的張力大小，正值，越小越好，通常20 kcal/mol以下比較合理。Pose列是對接構象編號，按照Grid Score從小到大排列。因此，第一個pose即為對接軟件根據打分判斷為最好的對接構象。

根據經驗，Grid Score>-40 kcal/mol屬于結合力較差，-40~-50kcal/mol屬于中等，<-50kcal/mol屬于較好。由于D715-2441分子較小，所以疏水作用面積小，范德華力貢獻自然較小，靜電力貢獻通常也不會很大，導致整體打分較差。這是可以理解的，也應理解為該對接構象還算合理。

從打分分布看，各個pose的打分相差不大，范德華力貢獻為主，第一個pose的靜電力貢獻相對其他pose出奇地大，意味著它具有較多較強的靜電作用力（比如氫鍵和鹽橋）。

仔細觀察各個pose，結合上面的對接打分。我們認為第一個pose 的作用力最多，結合力最好，結合方式符合預期，是最好的構象。對比文獻，這個pose與之幾乎完全一致（下面會解釋差異之處）。因此，我們選擇它來做結合模式分析。

為清晰起見，點擊視圖右側Protein下的cartoon按鈕，去掉cartoon樣式。點擊Ligand下的center按鈕，居中顯示配體。我們清晰地看到，化合物D715-2441的芳環(huán)結構夾在H357的咪唑環(huán)和F404的苯環(huán)之間形成三明治結構，并與之分別形成π-π堆積作用（黃線），還有與F404的疏水作用（灰線），這些作用力一起構成了范德華力，提供了約-35.48kcal/mol的結合力貢獻。另一方面，E361的羧基和K376的質子化N原子同時與苯環(huán)上的羥基形成氫鍵，氫鍵距離、角度可從下方表格查到。F404骨架上的氧原子也與D715-2441另一個羥基形成氫鍵作用。與文獻不同的是，K339的N+原子和H357的咪唑基都跟環(huán)酯基形成鹽橋作用。這種作用通常認為是非典型的，所以文獻未提及，但在我們的檢測分析工具里，它被呈現(xiàn)出來。這些極性作用為化合物的結合提供了較強的靜電力貢獻（約-7.69kal/mol），這也是該pose相對其他pose而言靜電力非常顯著的原因。

跟文獻存在差異的另一個地方是，文獻顯示Phe323與化合物存在π-π堆積作用，Phe325存在疏水作用。但在我們的分析結果中，并沒有出現(xiàn)這兩個作用力。實際上，這兩個氨基酸殘基距離底物稍遠，剛好超過該分析工具的相互作用力幾何判斷標準。但若將其原子結構顯示出來，即發(fā)現(xiàn)也在附近（下圖）。在柔性配體對接模式下，蛋白是剛性的，蛋白口袋的形狀、殘基位置未必是與配體最契合的。普遍認為，蛋白-配體之間存在“誘導契合”效應。在真實情況下，由于分子熱運動，蛋白、配體間距離不可能一成不變。對接計算只是展示了其靜態(tài)的一面，在真實世界里，幾何距離在臨界點附近的作用力可能“若隱若現(xiàn)”。

高質量的文章需要高質量的Figure。小編將在下期教大家使用PyMOL做上乘的蛋白-配體結合模式圖。敬請關注~

[1] Teng et al. A Small-Molecule Compound Has Anti-influenza A Virus Activity by Acting as a “PB2 Inhibitor”. Mol. Pharmaceutics, 2018, 15 (9), pp 4110-4120. DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.8b00531

[2] https://open-babel.readthedocs.io/en/latest/Forcefields/mmff94.html#mmff94-force-field