膜蛋白的結(jié)構(gòu)形成過程研究

1）膜蛋白的結(jié)構(gòu)形成過程研究

成孔毒素（Pore-forming toxin, PFT）能在靶細胞膜上寡聚化形成穿膜通道, 破壞細胞膜結(jié)構(gòu)并使其滲透性增強而導致細胞滲透性溶解。 PFT寡聚體在細胞膜上可以連接形成密排六方結(jié)構(gòu)（hcp）。

Lysenin是來源于蚯蚓的一種PFT，可在鞘磷脂/膽固醇（SM/chol）雙層膜結(jié)構(gòu)中寡聚化并形成hcp。實驗中，研究人員使用了日本RIBM的超高速視頻級原子力顯微鏡（HS-AFM），對SM/chol雙層膜結(jié)構(gòu)中l(wèi)ysenin寡聚體組裝成hcp的動態(tài)過程進行了實時成像，發(fā)現(xiàn)了hcp結(jié)構(gòu)形成的規(guī)律。

 

 

研究人員將lysenin與SM/chol雙層膜結(jié)構(gòu)在云母為基底的環(huán)境下共同培養(yǎng)后使用HS-AFM進行成像。下圖顯示了lysenin寡聚體形成的hcp在膜結(jié)構(gòu)上的分布。白色六邊形表示一個hcp單元，箭頭表示未完全形成的寡聚體。通過計算可以獲得Hcp單元的間距和寡聚體直徑等數(shù)據(jù)，與之前使用電鏡的研究獲得的數(shù)據(jù)一致。

 

 

通過HS-AFM還可以獲得lysenin寡聚體的三維圖像。對各個寡聚體的高度數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，可以發(fā)現(xiàn)高度分布主要為兩種，高度較低的寡聚體已經(jīng)嵌入了膜結(jié)構(gòu)中，并可能形成了核孔。

 

 

接下來研究人員對400×300nm區(qū)域內(nèi)的SM/chol雙層膜結(jié)構(gòu)上的lysenin組裝過程進行了動態(tài)成像。圖A展示了lysenin簇的形成并可以檢測簇的增長方向（圖B），最終組裝形成hcp結(jié)構(gòu)。 

在黑色的云母基底上也能觀察到lysenin，分析雙層膜結(jié)構(gòu)上和基底上的lysenin半徑大小可以得出，雙層膜結(jié)構(gòu)上的lysenin形成了寡聚體進而組成hcp結(jié)構(gòu)，而基底上的lysenin處于單體或不規(guī)則聚集形態(tài)，無法形成寡聚體，這也與之前的研究結(jié)果一致。

對視野內(nèi)的lysenin簇如B圖進行劃分并進一步分析可以得出：

1. Lysenin形成單個簇后，在雙層膜上水平擴散，聚集排列形成hcp結(jié)構(gòu)；

2. 新形成的簇會組成新的矩形排列（彩色矩形）或填充到已有的矩形排列的空缺處，有些已經(jīng)形成的簇會在膜上擴散或分解；

3. 矩形排列的方向可變（如最上方紅色矩形）；

4. 絕大多數(shù)Lysenin簇在裝配開始就會聚集形成簇，而不是隨機分布在膜上。

 

 

HS-AFM還可以在更高的放大倍數(shù)下以更高速率成像，以實現(xiàn)對lysenin簇組裝成hcp結(jié)構(gòu)的動態(tài)進行更詳細的檢測。

通過對結(jié)果的分析可以得出，大部分從外圍結(jié)合到hcp結(jié)構(gòu)區(qū)域的簇會以平均0.45秒的時間分解，而已經(jīng)形成hcp結(jié)構(gòu)的則相對更加穩(wěn)定，可能原因是內(nèi)部的lysenin寡聚體相互之間具有更多的結(jié)合位點，更難以分解。

 

 

 

小結(jié)：高速AFM成像可用于lysenin形成hcp結(jié)構(gòu)的動態(tài)過程的研究。lysenin簇于膜上形成，經(jīng)過大量的分解\重組和擴散形成hcp結(jié)構(gòu)，隨著膜上hcp數(shù)量的增多而趨向于穩(wěn)定。同時，我們還可以獲得簇的高度信息，用于表征lysenin與膜的結(jié)合以及穿膜通道的形成。

 

 2）膜蛋白的結(jié)構(gòu)形成機制研究

膜聯(lián)蛋白（Annexin）是于真核細胞的細胞質(zhì)內(nèi)普遍存在的一種蛋白，與多種細胞膜功能相關(guān)，如胞吞、胞吐以及離子轉(zhuǎn)運等。膜聯(lián)蛋白在鈣離子環(huán)境下可結(jié)合至磷脂，進行細胞膜修復等作用，但至今對于膜聯(lián)蛋白-鈣離子-磷脂三者的組裝與分解的動態(tài)過程的研究仍處于空白。

這項研究中，研究人員使用日本RIBM的超高速視頻級原子力顯微鏡（HS-AFM）引導了膜聯(lián)蛋白V（A5）的組裝與分解并進行成像，分析了過程中的蛋白結(jié)構(gòu)，動力學和分子間相互作用。

研究人員首先將雙層脂膜加入含2mM鈣離子的緩沖液，再加入A5并用HS-AFM成像�？梢杂^察到A5三聚體在膜上形成了六邊形晶格結(jié)構(gòu)（標記1），并在中間含有縱向高度更低的三聚體（標記2）或者空洞（標記3），這與先前使用其他AFM和電鏡的結(jié)果相一致。 

 

 

HS-AFM可以進行每秒幾十幀的更高速度的成像。對上圖中標記2的區(qū)域進行高速成像，三聚體依然保持了相似的尺寸和高度。在高速成像下，研究人員首次發(fā)現(xiàn)三聚體的方向會發(fā)生變化：向上（0°）和向下（60°）。此A5三聚體與其他形成了六邊形晶格結(jié)構(gòu)的三聚體相比，分子間相互作用更弱，使其能夠改變方向。

 

 

 

傳統(tǒng)的AFM和電鏡獲得的圖像是時間或空間的平均圖像，無法記錄極短時間內(nèi)的變化，因此難以發(fā)現(xiàn)三聚體方向的改變。通過HS-AFM的高速實時成像才發(fā)現(xiàn)并捕捉到了這一現(xiàn)象。

HS-AFM還可以與微流系統(tǒng)和激光等其他儀器結(jié)合，在實驗過程中對樣品和環(huán)境進行更多操作并實時成像，可以對兩種A5三聚體的組裝與分解進行更加深入、詳細的研究。

研究人員使用微流系統(tǒng)可向?qū)嶒灜h(huán)境加入EDTA,可以降低鈣離子含量，使三聚體形成的晶格結(jié)構(gòu)分解，同時，通過精確控制的流量可以精準地計算出加入EDTA的含量進行定量分析；整合的高精度紫外激光，可以對鈣離子籠鎖化合物進行解籠鎖操作，使其在實驗過程中可以多次反復釋放鈣離子。

 

起初，我們可以清晰地觀察到晶格結(jié)構(gòu)；277s時緩慢加入40mM EDTA后，晶格結(jié)構(gòu)分解；441s時啟動紫外激光，解籠鎖發(fā)生釋放出鈣離子，晶格結(jié)構(gòu)重新組裝；870s時關(guān)閉激光，晶格結(jié)構(gòu)再次開始分解。

進一步提高放大倍數(shù)后進行高分辨率成像，可以發(fā)現(xiàn)加入EDTA后，非六邊形晶格的A5三聚體相對于形成了六邊形晶格結(jié)構(gòu)的三聚體分解更快，對于鈣離子含量下降更加敏感。

 

 

小結(jié)：通過HS-AFM的高速、高分辨率成像以及與其他儀器的聯(lián)用，在體外構(gòu)建了實時生化反應環(huán)境，在對蛋白結(jié)構(gòu)直接成像的同時，發(fā)現(xiàn)了構(gòu)成膜聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)的兩種不同狀態(tài)的蛋白三聚體的差異，同時證明了鈣離子在蛋白組裝過程中的必要性。

3）膜蛋白的跨膜運動機制研究

谷氨酸鹽跨膜轉(zhuǎn)運蛋白（GltPh）的主要作用是通過跨膜轉(zhuǎn)運谷氨酸鹽，將突觸間隙的谷氨酸鹽濃度保持在興奮性毒性以下，防止神經(jīng)元死亡導致神經(jīng)系統(tǒng)疾病如癲癇、老年癡呆等。

GltPh如右圖所示，由一個固定在膜上的三聚體結(jié)構(gòu)域（橙色）和一個轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域（藍色）組成。在有鈉離子和谷氨酸的環(huán)境下，轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域可移動至膜的對側(cè)來轉(zhuǎn)運谷氨酸鹽；在無基底的環(huán)境下，轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域也可以跨膜移動。

之前，GltPh的直接動態(tài)成像很難實現(xiàn)，RIBM的超高速視頻級原子力顯微鏡（HS-AFM）攻克了這一難關(guān)，向我們展示了GltPh的跨膜升降運動。

 

 

實驗開始前，研究人員將GltPh純化后與脂類組成的囊泡整合成跨膜結(jié)構(gòu)，并用HS-AFM觀察。

在無基底的環(huán)境下，GltPh的三聚體結(jié)構(gòu)清晰可見。當每個轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域暴露在胞外的部分朝向顯微鏡的探針，即處于上升（up）狀態(tài)，突出的部分形成了一個三角形，中間則形成空洞（t=57s）；每個轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域也可朝向胞內(nèi)（t=58s），此時處于下降（down）狀態(tài)。

 

 

環(huán)境中單獨加入鈉鹽時，GltPh處于上升狀態(tài)的平均時間為33s，這意味著GltPh僅結(jié)合Na+離子時跨膜運動受到抑制。

加入充足的鈉鹽和谷氨酸，使環(huán)境濃度達到飽和后，GltPh處于上升狀態(tài)的平均時間為 11.1 s，開始進行活躍的跨膜轉(zhuǎn)運活動。

以上的結(jié)果證實了，當Na+和谷氨酸同時存在或缺失時，GltPh的跨膜運動相對于僅有Na+時更加活躍，GltPh是Na+和谷氨酸的協(xié)同轉(zhuǎn)運載體。

 

 

 

 HS-AFM在進行高速成像的同時，保持了很高的空間分辨率，可以清晰地分辨三聚體的每一個結(jié)構(gòu)域，使得我們可以對不同結(jié)構(gòu)域運動之間的關(guān)系進行研究。

我們針對一個GltPh三聚體，通過視頻統(tǒng)計的數(shù)據(jù)計算了其處于不同狀態(tài)（結(jié)構(gòu)域處于上升狀態(tài)的數(shù)量）的概率，結(jié)果與使用自由能公式計算出來的概率一致。

進一步對結(jié)構(gòu)域運動的關(guān)系進行統(tǒng)計，可以得出三聚體的結(jié)構(gòu)域之間運動是相互獨立的，這也直接驗證了之前的研究結(jié)果。

 

 

小結(jié)：使用HS-AFM獲得的高空間&時間分辨率的視頻級圖像，可以準確地反應生物大分子的運動狀態(tài)，用于精確定量研究。